饲用芽孢乳酸菌的生物学特性研究

武汉工业学院动物科学与营养工程学院

动物营养与饲料科学湖北省重点实验室 窦茂鑫 赵迪 丁斌鹰 侯永清 吴涛＊

微生态饲用添加剂具有良好的生物学活性，能调节动物胃肠道微生物菌群的平衡，促进动物消化吸收、生长发育，提高饲料转化率和生产性能，增强动物免疫力，以及具有改善饲养环境和减少环境污染的独特作用（Gomze等，2007；王旭明等，2002）。芽孢乳酸菌因其同时具有乳酸菌和芽孢杆菌的优点而成为为理想的益生菌之一 （相菲和徐厚春，2009）。本试验对饲用芽孢乳酸菌的生物学特性进行研究，以期为微生态饲料添加剂的研发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 试验益生菌：芽孢乳酸菌，由武汉泛华生物技术有限公司提供；试验致病菌：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，由华中农业大学国家农业微生物重点实验室提供。

1.1.2 培养基 普通琼脂培养基：酵母浸出物3 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，葡萄糖 15 g，琼脂 15 g，调整pH 7.2，定容至1000 mL。普通液体培养基：普通琼脂培养基中不加琼脂。

1.1.3 主要试剂 PBS缓冲液，用于菌液的稀释。

1.1.4 主要器材 电子天平 （沈阳龙腾电子有限公司），酸度计 （成都方舟科技开发公司），UV-1200 spectrophoto meter（美谱达仪器公司），立式超低温保温箱（海尔公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 芽孢乳酸菌的复苏 将-20℃保存的菌株按1%的接种量接种于普通液体培养基中，在37℃和165 r/min条件下培养10～12 h，待浑浊后进行后续试验。

1.2.2 生长曲线测定 将复苏后菌液按5%的接种量接种于普通液体培养基中，在37℃和165 r/min条件下培养，以普通液体培养基作校正，测定不同时间段培养液的OD600值，前24 h每1 h一测，后36 h每2 h一测。

1.2.3 产酸能力测定 将复苏后菌液按5%的接种量接种于普通液体培养基中，在37℃和165r/min条件下培养，测定不同时间段培养液的pH（郭志杰等，2010）。

1.2.4 高温耐受性试验 将复苏后菌液按1%的接种量接种于PBS缓冲液中，分别置于60、70、80、90℃的水浴锅中处理10 min，分别于处理前和处理后进行平板涂布，计算存活率 （范俊娟，2009）。

1.2.5 耐酸性试验 用盐酸调节PBS缓冲液的pH 分别为 2.0、2.5、3.0、4.0，121 ℃高压灭菌后备用。将复苏菌液按1%的接种量接种于上述pH梯度稀释液中，37℃作用3 h，涡旋混匀，涂布平板进行活菌计数，以0 h计数为对照，计算存活率（刘文华等，2008）。

1.2.6 耐胆盐试验 用PBS缓冲液配制浓度分别为0.2%、0.5%、0.8%、1.0%的猪胆盐溶液，高压灭菌后备用。按1%的接种量将复苏菌液接种于上述不同浓度的猪胆盐溶液中，37℃作用3 h后，涂布平板进行活菌计数，以处理前细菌数为对照，计算存活率（赵瑞香等，2004）。

1.2.7 抑菌性试验 将致病菌分别培养12～24h，按20倍稀释，取100 μL致病菌液均匀涂布到事先准备好的无菌琼脂平板上。采用牛津杯法，每个试验设3个重复，37℃培养12～24 h，测定抑菌圈直径，以无菌普通液体培养基作对照 （郭志杰等，2010）。

2 结果

2.1 芽孢乳酸菌的生长曲线测定结果 由图1可知，芽孢乳酸菌未经过迟缓期，直接进入对数期生长，0～6 h生长速度最快，6～18 h生长速率减缓，18～26 h生长速率有所提高，26～34 h生物量变化不明显，达到稳定期，34 h生物量开始降低，进入衰亡期。

2.2 芽孢乳酸菌的产酸能力测定结果 由图2可知，0～10 h芽孢乳酸菌产酸能力非常强，培养液的pH迅速降低，10～12 h培养液pH有短暂的回升，然后又继续降低，32 h pH为3.60，此时pH降到最低。之后pH逐渐升高，最后pH在3.80左右趋于稳定。

图1 芽孢乳酸菌生长曲线测定结果

图2 芽孢乳酸菌产酸能力测定结果

2.3 芽孢乳酸菌的高温耐受性试验结果 由图3可知，对芽孢乳酸菌进行高温处理后发现，芽孢乳酸菌在60℃处理10 min后存活率达94.37%，90℃处理10 min后存活率高达70%以上，说明芽孢乳酸菌对高温有较好的耐受性。

图3 芽孢乳酸菌高温耐受性试验结果

2.4 芽孢乳酸菌的耐酸性试验结果 益生菌要到达肠道发挥作用，必须经过胃酸的作用，因此其必须具有良好的耐酸能力，才能到达肠道发挥功能。由图4可知，对该芽孢乳酸菌进行酸处理后发现，芽孢乳酸菌在pH 2.0环境中存活率高达54.69%，说明芽孢乳酸菌具有较好的耐酸特性。

2.5 芽孢乳酸菌的耐胆盐试验 结果 益生菌到达十二指肠时要受到胆盐的抑制作用，因此必须有较高的胆盐耐受性，才能发挥益生特性。由图5可知，对该芽孢乳酸菌进行胆盐处理后发现，芽孢乳酸菌在0.2%猪胆盐溶液中存活率在90%以上，在1.0%的猪胆盐溶液中存活率超过20%，说明芽孢乳酸菌具有较强的耐胆盐特性。

图4 芽孢乳酸菌耐酸性试验结果

图5 芽孢乳酸菌耐胆盐试验结果

2.6 芽孢乳酸菌的抑菌性试验结果 由表1可知，芽孢乳酸菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，其中对沙门氏菌的抑菌性最强，抑菌圈直径为19.76 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌性最弱，但抑菌圈直径也较大。总体看来，芽孢乳酸菌对肠道常见致病菌具有较强的抑制作用。

表1 芽孢乳酸菌抑菌试验结果

3 结论

益生菌通过添加到饲料进入胃肠道,在胃肠道中定殖,并能通过大量繁殖的有益菌发挥其益生作用。研究表明,理想的益生菌应具有生长速度快、对胃肠道环境(胃酸、胆盐等)耐受能力强,具有一定的抑菌能力等特点 （Geimonde和Salminen，2006）。 Hyronymus等（2000）研究报道,芽孢乳酸杆菌、左旋乳酸芽孢杆菌、消旋乳酸芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌在pH 2.0中生长受到强烈的抑制。Guo等（2006）研究发现，中低质量分数胆盐(≤0.3%)对芽孢杆菌的存活影响很小；而高质量分数的胆盐（>0.3%）对不同来源菌株的耐受能力就表现出明显的差异（王焕等，2008）。芽孢杆菌的抑菌作用，不同菌株各有不同。王德培等（2010）对分离到的1株枯草芽孢杆菌的抑菌谱进行了研究，结果表明，该枯草芽孢杆菌具有广谱抗真菌活性。陈家祥等（2010）研究报道，加地衣芽孢杆菌有益于肉鸡的肠道发育，能够抑制盲肠内有害菌的生长。

本试验表明，此株芽孢乳酸菌具有较好的生长性能和产酸能力，在24 h之后会逐步进入稳定期，最终pH值会达到3.80左右，这有利于在消化道内定植后快速生长及维持消化道的酸性环境。此外，芽孢乳酸菌具有优良的生物学特性，可耐受90℃高温，有利于微生态添加剂的生产；能耐受pH 2.0的酸性环境，存活率达到50%以上，使芽孢乳酸菌能顺利通过胃内酸性环境到达肠道发挥生物学功能；对猪胆盐溶液也有较高的耐受性，在发挥功能的同时免受猪胆汁酸的抑制作用。从整体水平可以看出，此株芽孢乳酸菌具有较好的生物学功能，可以作为微生态饲料添加剂生产使用。

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