酶法降解茶叶多糖技术研究

安徽农业大学生命科学学院 黄世霞 王在贵＊ 刘学诗

茶叶多糖（tea polysaccharides，TPS）是从茶叶中提取出来的多糖类复合物，具有降血糖、降血脂、抗氧化、增强免疫力等多种生物学功能 （招钰等，2007；李布青等，1996）。其相对分子质量为40000～100000，易溶于热水，不溶于高浓度的有机溶剂（徐仲溪和王坤波，2004）。茶多糖的溶解性是其性质的一项很重要的指标，一般多糖分子质量越大，溶解性越低，不利于多糖穿越多重细胞内膜系统，从而影响其生物活性（Chen等，2009）。而低分子质量的多糖易于肠壁细胞结合，具有抑制有害菌，阻止肠道毒素的吸收等生理功能。目前关于低分子质量的茶叶多糖的制备及其生理活性的研究仍鲜有报道。本研究利用酶法降解茶多糖降低其聚合度，并研究了最适酶解参数，以期为茶叶低聚糖的制备及其生理活性的研究提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 茶叶多糖（由本实验室提供），纤维素酶，木聚糖酶，β-葡聚糖酶（由某生物股份有限公司提供，于-30℃冰箱中保存）。柠檬酸、磷酸氢二钠、苯酚、酒石酸钾钠、羧甲纤维钠、3，5-二硝基水杨酸（DNS）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 分别吸取0.1 mg/mL 葡 萄 糖 溶 液 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL依次加入试管中，分别补加入蒸馏水至1.5 mL。每管中加3 mL DNS于沸水中煮10 min，自来水冷浴冷却，加入10 mL蒸馏水稀释混匀，于550 nm处进行比色测定，用空白管调零点，测定OD550，以葡萄糖浓度为横坐标，以OD550为纵坐标绘制出标准曲线。每组2个平行。（注：每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线）。

1.2.2 茶叶多糖最适降解酶的筛选 取5 mg/mL茶叶多糖1 mL，分别加入0.5 mL木聚糖酶，0.5 mL纤维素酶，0.5 mL β-葡聚糖酶和0.5 mL混合酶液（1 mL β-葡聚糖酶与3 mL纤维素酶混合），40℃水浴10 min，然后分别加入3 mL水杨酸，迅速放到沸水中水浴10 min，冷却，再分别加10 mL去离子水摇匀，测定OD550。

1.2.3 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的最适温度设定恒温水浴锅温度分别为 30、35、40、45、50、55、60、65℃和70℃；茶叶多糖浓度为5 mg/mL，pH 7.0，反应时间为 10 min，测定 OD550。

1.2.4 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的热稳定性测定 将β-葡聚糖酶分别放到60、70℃水浴锅中保存 10、20、30、60、120、180、240 min， 每个时间终点取出1.5 mL酶液，按照上述方法测定OD550。

1.2.5 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖最适pH 用pH 分别为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0的缓冲液配置浓度为5 mg/mL的茶叶多糖溶液，酶解温度为37℃，反应时间为10 min，测定OD550。

1.2.6 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖pH稳定性测定用 pH 分别为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液适当稀释β-葡聚糖酶，37℃下水浴16 h后，测定各处理样品降解茶叶多糖的OD550。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 葡萄糖标准曲线方程为 y=0.6071x-0.0057，R2=0.9954。

2.2 茶叶多糖最适降解酶筛选结果 用木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶以及纤维素酶与β-葡聚糖酶的混合酶液分别降解茶叶多糖，结果见图1。由图1可见，β-葡聚糖酶能很好的降解茶叶多糖，纤维素酶次之，复合酶液效果较差，木聚糖酶最差。

图1 不同酶液对茶叶多糖的降解效果的影响

2.3 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的最适温度 用pH 7.0缓冲液配制的茶叶多糖溶液，在不同温度（30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃） 条件下测定β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的活力，结果见图2。由图2可知，β-葡聚糖酶降解茶叶多糖反应最适温度为40℃，合适反应温度为35～45℃。

2.4 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖热稳定性的测定结果 在不同温度条件下，于不同的时间点取出部分酶液测定酶解茶叶多糖能力，以未经过处理的酶液为对照，计算剩余活力，结果见图3。由图3可见，经过降解的茶叶多糖在60、70℃条件下，随时间的延长酶活均会逐渐下降，70℃条件下保温120 min已无酶活，60℃条件下保温180 min酶活消失。

图2 不同温度对β-葡聚糖酶酶解茶叶多糖效果的影响

图3 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的热稳定性

2.5 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的最适pH 在不同pH条件下测定β-葡聚糖酶降解茶叶多糖后的OD550值，结果见图4。由图4可知，β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的最适pH为7.0，合适pH范围为6.0～8.0。

图4 不同pH对β-葡聚糖酶酶解茶叶多糖效果的影响

2.6 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的pH稳定性测定结果 由图5可知，在pH为4.0～7.0酶活稳定上升，而当pH高于7.0时酶活开始下降。pH为6.0～7.0酶活较稳定。

3 讨论

图5 β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的pH稳定性

木聚糖酶是降解木聚糖的β-1，4糖苷键的水解酶。纤维素酶为多种水解酶组成的复合酶系，可分解葡聚糖的β-1，4糖苷键；β-葡聚糖酶可催化水解葡聚糖的β-1，4糖苷键和β-1，3糖苷键。本研究结果表明，纤维素酶和β-葡聚糖酶相对木聚糖酶具有较强分解茶叶多糖的能力，其中β-葡聚糖酶酶解效果最佳。由此可见，茶叶多糖的一级结构存在一定β-1，3-糖苷键连接。

本研究对β-葡聚糖酶降解茶叶多糖的主要特性进行了进一步的研究。吴琪等（2011）研究表明，β-葡聚糖酶的最适反应温为40～50℃，最适反应pH为7.5。郭雨桐和肖文军（2011）研究发现，β-葡聚糖酶降解茯苓多糖的最适反应温度为55℃，最适pH为5.5。本试验结果表明，β-葡聚糖酶对茶叶多糖降解的最适温度为40℃，最适pH为7.0。戴易兴等（2011）利用乳糖诱导基因工程菌产的β-葡聚糖酶热稳定性较好，在70℃左右下活力较高。关于降解茶叶多糖的最适酶及酶解体系仍需做进一步研究。

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