卡铂联合多西他赛化疗对宫颈癌组织中survivin蛋白表达的影响

西安交通大学医学院第二附属医院妇产科（西安710004） 薛 翔 韩红芳 段 钊 公丕军

宫颈癌为妇科最常见的肿瘤，近年的发病有明显的年轻化趋势，过去宫颈癌治疗以手术和放疗为主，但对部分有生育要求的病人，手术和放疗均存在很大的局限［1］；随着新辅助化疗的提出，近年来，宫颈癌的化疗取得了较好的治疗效果；宫颈癌的化疗方案有多种，卡铂联合多西他赛为最近提出的一种方案，我们通过检测survivin表达对该方案的作用机理进行研究。

材料与方法

1 材 料 选择我院2009年1月至2011年6月行静脉＋手术治疗且临床分期为Ⅰb～Ⅱb期宫颈癌患者60例。年龄23～62岁，平均44.5岁，其中≤40岁15例。鳞癌55例，腺癌5例。

2 治疗方法 所有病人入院后，两名副主任医师以上医师对病人进行临床分期。化疗前取活检，活检癌肿放入－80℃冰箱保存。所有患者均采用静脉化疗方案：多西他赛75mg/m2溶于0.9%氯化钠液250ml中，第1天静脉滴注1h；卡铂350mg/m2，用生理盐水溶解后，再稀释至500ml，静脉滴注，滴注时间不应少于1h，滴完后需继续点滴输液1000ml以上，第1天化疗，然后水化2d，间隔3周再次重复。所有病例均化疗3个疗程后，根据肿块缩小情况选择手术或者放疗。

3 RT－PCR半定量分析 引物均由上海生物公司合成。survivin引物为：上游引物：5’－AGGCTGGCTTCATCCACT－3’， 下 游 引 物：5’－CACCAAGGGTTAATTCTTCA－3’，产物长度180bp。上游 引 物：5’－CCAGAGCAAGAGAGGCATCC－3’，下游引物：5’－CCGTGGTGGTGA AGC TGT AG－3，总长度437bp。组织总RNA提取按照Trizol（Qiagen，USA）剂盒说明书的操作步骤，按1×107/ml Trizol的比例提取组织总RNA；按照翻转录试剂盒（MBI，USA）说明书在20μl的反应体系中合成细胞总cDNA；PCR体系为50μl，内含模板2μl，Taq酶5U（TAKA－RA，Japan），目的引物各1μl，补足为50μl。反应条件除退火温度外均为预变性94℃4min，变性94℃30s，退火30s，延伸72℃30s，25个循环数。退火温度依次为survivin为59.5℃，β－actin为57.5℃。

4 细胞凋亡检测 人宫颈癌组织活检或者手术切除离体半小时内，含1000U/ml的青霉素（Gibco，USA）和1000μg/ml链霉素（Gibco，USA）PBS冲洗以去除污染的红细胞；将其剪成小碎片，0.5mg/ml胶原酶IV＋DMEM/F12（Gibco）、37℃中消化过夜，1500g离心，弃 上 清，0.025mmol/L EDTA－胰 酶 （Gibco，USA）37℃消化半小时，用去离子水按1∶4稀释结合缓冲液（20ml结合缓冲液＋60ml去离子水）。用250μl结合缓冲液重新悬浮细胞，使其浓度为1×105/ml。加100μl的细胞悬液入5ml流式管中，每管加入5μl Annexin V/FITC和5μl 20μg/ml的 PI，避光混匀，标记15min。对照不加Annexin V作校正因子。在反应管中加入400μl PBS。用流式细胞仪（FACS）检测，光源为488nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光。

5 统计学处理 数据均采用SPSS11.0统计软件进行统计。细胞凋亡和增殖指数用均数±标准差表示。采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

化疗3个疗程后，绝大多数患者肿块明显缩小（53/60，88.3%）。RT－PCR 检测survivin表达，化疗后survivin表达明显下降，即使肿瘤缩小不明显的患者，其survivin表达亦明显下降；细胞凋亡明显增加。见附表。

附表化疗前后survivin的表达及肿瘤细胞凋亡率

讨 论

宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌居第2位，在发展中国家妇女中其发病率居第一位［1－2］。因为宫颈癌病人的年轻化，传统的手术后病人无法生育，而放疗又对卵巢功能有很大的影响［3］，使人们意识到了宫颈癌给予化疗的可能性。早在1982年Frei提出肿瘤手术前早期辅助化疗的概念以来［4］，宫颈癌化疗的方案也越来越多，化疗以后的效果，越来越受到国内外学者的重视［4］。

多西他赛是半合成的紫杉类抗肿瘤药，抗瘤谱较紫杉醇广，可以与游离微管蛋白结合，促进微管蛋白组装成稳定的微管，其作用是紫杉醇的2倍，并抑制其解聚，从而抑制细胞有丝分裂，另外多西他赛还是一种有效的Bcl－2磷酸化诱导剂，可以诱导Bcl－2蛋白过度表达的实体瘤细胞凋亡。常见的主要剂量限制性毒性为迟发性腹泻和中性粒细胞减少，其它的毒性反应为胆碱能综合征，恶心、呕吐、乏力、脱发。卡铂为铂的金属络合物，作用似烷化剂，主要作用靶点为DNA，作用于DNA链间及链内交链，形成DDP－DNA复合物，干扰DNA复制，或与核蛋白及胞浆蛋白结合。属周期非特异性药，主要副作用为消化道反应、肾毒性、骨髓抑制［5］。

生存素（surviving）是新近发现的一种肿瘤特异性凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族新成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白，同时参与血管形成的作用［6］。survivin可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子［7］。survivin和其他IAP蛋白的分布和表达模式不同，其他IAP蛋白在生理情况下广泛分布于成人各种组织中，不同之处仅为表达水平的不同；survivin仅表达于胚胎和胎儿发育过程中，并且随着胚胎组织的发育成熟，survivin的分布逐步局限，表达水平逐渐降低直至不表达。在正常成人，除了在胎盘、胸腺、增生期和分泌期的子宫内膜中有较弱的表达外，其余正常分化成熟组织均未发现。survivin在几乎所有的癌组织中均有表达。文献报道的宫颈癌的survivin的表达35%～90%，survivin蛋白的表达率和表达量与肿瘤不良预后、临床分期、淋巴结转移和肿瘤周围浸润成正相关［8］。现有研究表明肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控、分化异常的结果，而且与细胞凋亡失衡有关。多种因素综合作用，导致细胞过度增殖和（或）凋亡抑制，进而造成细胞无限生长，从而形成肿瘤。survivin是新近发现的一种凋亡抑制基因，其独特的结构、特殊的组织分布和作用机制及明显的抗凋亡作用尤为引人注目；survivin与细胞凋亡指数成负相关［9］。

新辅助术前化疗（NACT）的目的一是希望化疗后局部肿瘤缩小，从而可减少切除范围，降低手术造成的损伤；其次是化疗可清除或抑制可能存在的微转移灶，从而改善预后。但是NACT的确切机制尚不清楚，我们推测肿瘤的发生、发展是多基因相互作用的结果。新辅助化疗的分子机制已经有了一系列的研究，发现其可以下调部分肿瘤基因的表达，促进肿瘤细胞凋亡。本研究表明卡铂联合多西他赛可有效抑制survivin表达，引起肿瘤细胞凋亡，从另外一个角度对宫颈癌的辅助化疗机制进行了探讨，而且奈达铂联合伊立替康在宫颈癌化疗中的良好效果，亦说明这种化疗方案值得在临床上进一步推广，而这种方案引起宫颈癌中survivin的表达下调亦说明了其的一部分作用机理。

［1］ 李艳红，张 伟，朱少君，等.早期宫颈癌筛查有效方案的探讨和研究［J］.陕西医学杂志，2006，35（7）：842－843.

［2］ Haie－Meder CP，Castiglione MM.Cervical cancer：ESMO clinical recommendations for diagnosis，treatment and follow－up［J］.Ann Oncol，2009，20，4：27－28.

［3］ Nakano T，Ohno T，Ishikawa H，et al.Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer［J］.J Radiat Res（Tokyo），2010，51（1）：1－8.

［4］ Frei E.Clinical cancer research：an embattled species［J］.Cancer，1982，50（10）：1979－1992.

［5］ Hiruma R，Kamide T，Anzai N，et al.Combined irinotecan （CPT－11）and nedaplatin （254－S）therapy for advanced and/or recurrent cervical cancer［J］.Gan To Kagaku Ryoho，2008，35（4）：607－610.

［6］ Monzo M，Rosell R，Felip E，et al.A novel anti－apoptosis gene：Re－expression of survivin messenger RNA as a prognosis marker in non－small－cell lung cancers［J］.J Clin Oncol，1999，17（7）：2100－2104.

［7］ Muchmore SW，Chen J，Jakob C，et al.Crystal structure and mutagenic analysis of the inhibitor－of－apoptosis protein survivin［J］.Mol Cell，2000，6（1）：173－182.

［8］ Kim HS，Shiraki K，Park SH.Expression of survivin in CIN and invasive squamous cell carcinoma of uterine cervix［J］.Anticancer Res，2002，22（2A）：805－808.

［9］ Chiu HW，Ho YS，Wang YJ.Arsenic trioxide induces autophagy and apoptosis in human glioma cells in vitro and in vivo through downregulation of survivin［J］.J Mol Med，2011，