高效液相色谱法测定唇齿清胃丸中大黄酚含量

2012-04-25刘凤松

长春中医药大学学报 2012年5期

刘凤松

(中国医药工业有限公司质量管理部,北京 100190)

唇齿清胃丸质量标准的修订是国家药品质量标准行动计划之一。唇齿清胃丸剂型为丸剂，功能为清胃火，用于由胃火引起的牙龈肿痛，口干唇裂，咽喉痛。唇齿清胃丸是由大黄、黄芩、龙胆、栀子等14味中药材组成的复方制剂，其中大黄为该药的君药[1-2]。本试验采用高效液相法测定唇齿清胃丸中大黄酚的含量，结果表明本方法简便快速、灵敏度高、结果准确，可作为控制本品质量的较好方法。

1 方法

1.1 仪器与试药岛津LC-2010CHT高效液相色谱仪；岛津UV-2450紫外分光光度计；Mettler AE-163电子分析天平(准确度:0.000 1 g)；DK-S26型电热恒温水浴锅；大黄酚对照品(批号：110796-2003)由中国药品生物制品检定所提供，甲醇(国药集团试剂公司)为优级纯，甲醇(默克)色谱纯，水为超纯水，三氯甲烷(天津四友化学品有限责任公司)、磷酸、盐酸(天津天泰精细化学品有限公司)为分析纯。

1.2 色谱条件色谱柱：Agilent-C18(5 μ，Φ4.6×250 mm)；以甲醇-0.1%磷酸(85∶15)为流动相。流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm。柱温为30 ℃。理论板数按大黄酚峰计算不低于5 000。

1.3 对照品溶液的制备精密称取大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL含大黄酚12.12 μg的溶液，作为对照品溶液。

1.4 供试品溶液的制备将本品剪碎，取1 g，精密称定，加硅藻土1 g，研匀，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放置至室温，再称定重量，加甲醇补足减失的重量,摇匀，滤过。精密量取续滤液20 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液20 mL，超声处理(250 W，40 KHz)2 min，再加三氯甲烷20 mL，加热回流1 h,放置至室温，置分液漏斗中。用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，静置分层，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，依次为20、10、10 mL。合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并定量转移至10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2 方法学考察

2.1 系统适用性试验

2.1.1 测定波长的选择取大黄酚对照品甲醇溶液适量，适当稀释，在波长220～280 nm范围内测定其紫外吸收光谱(附图)，测得大黄酚的最大吸收波长为255.4 nm,参考《中国药典》2010年版一部大黄【含量测定】项下的有关规定，紫外吸收图谱表明大黄酚对照品在254 nm有最大吸收，故确定254 nm为大黄酚的测定波长。

2.1.2 色谱柱的考察在实验过程中曾考察3种色谱柱：1)Diamorsil-C18(5 μ,250 mm×4.6 mm)(迪马公司)，2)Shim-pack ODS(5 μ，150 mm×6.0 mm)(日本岛津公司)，3)Agilent-C(5 μ，Φ4.6×250 mm)，经比较后,三根色谱柱的分离效果和色谱峰行为均良好。表明大黄酚对色谱柱适用性强，比较容易满足，本试验采用Agilent-C18(5 μ，Φ4.6×250 mm)色谱柱主要是由于其保留时间较短，理论板数较高。

2.1.3 提取方法的考察

2.1.3.1 硅藻土加入量的考察在供试品溶液制备的摸索过程中，试验比较了加入硅藻土0.5、1、1.5 g后测定其大黄酚的量,结果加入0.5 g硅藻土的样品由于样品分散不完全，测定结果偏低；加入1、1.5 g的结果基本一致。所以本试验采用加入硅藻土的量为1 g。

2.1.3.2 甲醇加入量的考察在供试品溶液制备的摸索过程中，试验比较了分别加入甲醇25、50、100 mL后测定其大黄酚的含量，结果加入甲醇25 mL的样品由于甲醇量较少,对大黄酚的提取不充分，测定结果偏低；加入50、100 mL的结果基本一致。所以本试验采用加入甲醇的量为50 mL。

2.1.3.3 甲醇液回流时间的考察在供试品溶液制备的摸索过程中，试验比较了甲醇回流时间分别为30、60、90 min后测定其大黄酚的含量，结果表明，回流30 min的测定结果偏低，可能是由于回流不充分而造成大黄酚提取不完全；回流60 min与回流90 min后的测定结果表明，二者测得的大黄酚含量差异不大,基本一致。本试验采用的甲醇回流时间为1 h。

2.1.3.4 加入酸溶液的种类及浓度的考察在供试品溶液制备的摸索过程中，比较了用硫酸，盐酸两种酸液分别水解待测物，结果表明：硫酸的氧化性过强，在回收溶剂时易使供试品氧化变黑，对供试品有一定的破坏作用，测定结果偏低；盐酸的水解效果好，且氧化性较弱，测定所得大黄酚的量较高，且平行。所以本试验采用加入盐酸来水解待测物。

实验还比较了3种浓度的盐酸酸水解方法，浓度分别为5%，8%，15%，测定其大黄酚的量，结果表明：加入5%的盐酸后水解不充分，测的大黄酚含量偏低，且干扰成分过大；加入8%，15%的盐酸后测定大黄酚的含量基本一致。所以本试验选取加入盐酸的浓度为8%。

2.1.3.5 酸水解回流时间的考察实验比较了3个酸水解回流时间，分别为1、1.5、2 h，测定其大黄酚的含量，结果表明:用3个回流时间测得的大黄酚含量基本一致。本试验采用的三氯甲烷回流时间为1 h。

2.1.3.6 三氯甲烷提取次数的考察实验比较分析了三氯甲烷提取次数分别为3、4、5次后测定其大黄酚的含量，结果表明：提取4次和提取5次的测定结果与提取3次的测定结果基本一致,说明提取3次已经可以将酸液中剩余的大黄酚基本提取完全。本试验采用的三氯甲烷提取次数为3次。

2.2 阴性对照试验为进一步考察实验设计的合理性，取按处方配比不含大黄的阴性对照样品，依法测定，结果阴性样品色谱图在大黄酚峰相应的保留时间附近均无干扰峰检出，从而证明本法是合理可行的。

2.3 标准曲线的制备精密称取大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL含12.12 μg的溶液。分别精密吸取1、3、5、7、9、11 μL,注入液相色谱仪，测定，以对照品进样量为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，Y=7 200 887.55X-561 9.04(r=1.000 0)。结果表明,进样量在12.12～133.32 μg范围内与峰面积值呈良好线性关系，符合外标法定量测定的要求。

2.4 精密度试验精密吸取上述供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪，重复6次，测定色谱峰面积值，RSD=0.06%。结果表明，所用仪器具有良好精密性。

2.5 稳定性试验取同一供试品溶液,按上述色谱条件在0～24 h内测定其大黄酚峰面积值，结果RSD=0.12%，表明，在24 h内，供试品溶液中大黄酚的含量基本稳定。

2.6 重现性试验取同一供试品，依上述方法独立测定6次，结果平均值0.381，RSD=0.76%。结果表明，本法重现性良好，精密度较高。

2.7 加样回收率试验精密称取同法测定已知含量的供试品6分，每分约0.5 g,分别精密加入大黄酚对照品甲醇溶液(浓度为0.062 8 mg/mL)3 mL，挥干，加硅藻土1 g，研匀，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，称重，加热回流1 h，放置至室温，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，置烧瓶中,挥去溶剂，加8%盐酸溶液20 mL，超声2 min，再加三氯甲烷20 mL，加热回流1 h，放至室温，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，静置分层，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，依次为20、10、10 mL。合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并定量转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液依法测定，计算回收率，测得平均回收率为99.74%；RSD=0.59%。结果表明,本法回收率较高，准确度良好。

2.8 最低定量限的测定精密称取大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL含大黄酚12.12 μg的溶液，精密量取1 mL,置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密量取0.5 μL注入液相色谱仪，此时所得对照品峰高为噪声的10倍，按照《中国药典》规定，此时对照品的进样量为定量限，故此方法的定量限为0.121 2 μg。