uPA／PAI－1在乳腺癌中的表达及其临床意义的研究进展

董 欢（综述） 林燕苹 应学翔 何萍青（审校）

（上海交通大学附属第六人民医院普外科 上海 200233）

目前，乳腺癌的发病率不断升高，已经成为女性中最高发的恶性肿瘤之一，在过去的几十年内系统性治疗已使乳腺癌的死亡率大大降低，主要的致死原因是肿瘤的远处转移。肿瘤的转移是一个多步骤参与的复杂过程，包括了肿瘤的局部浸润、降解细胞外间质（extracellular matrix，ECM）、进入血液循环及在新的部位种植生存。传统的预后指标如年龄、月经状态、肿瘤大小、病理组织学分级、淋巴结状态、激素受体情况和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER－2）状态等并不能完全反映出宿主、肿瘤及环境的所有信息，由此来评价预后及制定治疗方案可能有偏颇。因此，与肿瘤侵袭转移有关的一些指标在不断研究发展中，其中最主要的成员之一是尿激酶型纤溶酶原反应系统，这一系统包括了尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase－type plasminogen，uPA）及其受体（uPA receptor，uPAR）与纤溶酶原激活物抑制因子－1（plasminogen inhibitor 1，PAI－1）。随着乳腺癌早期诊断水平的提高，淋巴结阴性患者的比例增高，这一反映乳腺癌侵袭指标的纤溶酶原反应系统的预后价值越来越凸显，本文对uPA／PAI－1在乳腺癌中的表达及其临床意义作一综述。

uPA在乳腺癌浸润转移中的作用uPA是一种丝氨酸组蛋白酶，在正常细胞和肿瘤细胞均有表达，其最初的分泌形式为一种无酶活性的单链酶原，即纤溶酶原激活物前体（pro－uPA），pro－uPA通过纤溶酶的裂解作用成为活性形式uPA。uPA能够将纤溶酶原转化为有源矩阵丝氨酸组蛋白纤溶酶［1］，并通过蛋白水解作用降解肿瘤组织周围多种上皮膜蛋白及基底膜成分；它同时也能活化多种生长因子，并促使上皮膜蛋白降解基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）。在肿瘤进展过程中，uPA、uPAR、PAl－1及 MMP相互作用，从而使得肿瘤细胞易于浸润组织［1－2］。uPA和 MMP受到一系列的生长因子的调控，特别是表皮生长因子及其受体。研究发现，细胞外基质金属蛋白酶诱导物（extracellular MMP inducer，EMMPRIN）是一种高度甲基化的免疫球蛋白家族成员，存在于肿瘤细胞及其间质的细胞膜表面，与恶性肿瘤进展相关［3］。Giusti等［4］的研究发现，一种表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的配体可以通过促进产生uPA而引起肿瘤细胞扩增。研究也显示，多种实体瘤中都常见表皮生长因子受体信号通路激活，伴随表皮生长因子受体增加，EMMPRIN在乳腺癌中的表达也明显增加［5］。可能正是通过上调EMMPRIN在乳腺癌中的表达，EGFR增加了uPA和MMP的表达，从而使得肿瘤易于浸润。

PAI－1在乳腺癌浸润转移中的作用纤溶酶原激活物抑制因子（plasminogen inhibitor，PAI）属于丝氨酸蛋白酶抑制因子家族，目前已知有PAI－1、PAI－2、蛋白酶nexin和蛋白酶 C抑制剂（protein C inhibitor，PCI）4种。PAI－1和 PAI－2是uPA 的主要抑制物，但PAI－1的活性远高于PAI－2，并且两者与肿瘤预后的相关性也截然不同。PAI－1与细胞的移行、转移及血管新生相关［6］，其高表达与肿瘤不良预后密切相关［7－9］。最新研究认为是PAI1特殊的分子结构使得它未能发挥抑制纤溶酶原激活物的作用［10］。PAI－1通过与uPA形成稳定的复合物，对纤溶酶原的形成产生负反馈抑制作用，PAI－1能够诱导肿瘤细胞对复合物产生细胞内摄取作用，因而促进肿瘤细胞侵袭基底膜。PAI－1与整合素（integrin）、玻璃粘连蛋白（vitronectin，VN）、层粘连蛋白（laminin，LN）通过细胞内信号转导途径影响肿瘤细胞迁移及增殖。PAI－1／VN 复合物能使PAI－1具有抑制剂无关的功能。uPA－PAI－1复合物也可以通过与低密度脂蛋白（low density lipoprotein receptor，LDLR）家族的交互作用而间接地影响信号活性，更可以直接通过受体胞质区发出细胞信号［11］。PAI－1同样可以刺激细胞发生不依赖uPA、组织纤维蛋白溶酶原激活（tissue plasminogen activator，tPA）和粘连蛋白的细胞移行。另一项研究也证明［12］，PAI－1和LDLR相互作用后，可间接导致刺激细胞JaK／STAT信号通路的活化，从而导致细胞移行的增加。

uPA／PAI－1表达对早期乳腺癌临床预后的预测及化疗、内分泌治疗的指导作用对于乳腺癌患者，一些传统的预后因素很重要，其中之一就是淋巴结状态，它是评估早期乳腺癌危险分级最重要的因素。由于淋巴结状态并不影响系统治疗反应性，因此它只是纯预后因素［13］。考虑到淋巴结阴性乳腺癌比例的升高和对潜在治愈患者过度治疗现象的不断出现，充分评估淋巴结阴性乳腺癌患者的复发风险特别重要。严格按照St．Gallen共识原则［14］，90%以上的淋巴结阴性乳腺癌患者将得到全身治疗，虽然仅30%的患者将最终复发。在淋巴结阴性乳腺癌患者中，由uPA和PAI－1水平筛选出的低危患者约占50%［9］，明显高于前者，因此更接近局部治疗可治愈的淋巴结阴性患者的实际比例（70%）。

欧洲癌症研究组织（EORTC）对来自欧洲18个不同地区的8 377名早期乳腺癌患者中位随访6．5年的数据进行分析［15］，最重要的发现是uPA和PAI－1是仅次于淋巴结状态的无病生存和总生存最可靠的预后因素。在包括所有预后因素（年龄、肿瘤大小、淋巴结累及情况、激素受体状态和组织分级）以及辅助治疗的多因素分析中，uPA和PAI－1仍是重要而可靠的危险因素。另外，并未发现其与激素受体状态存在相关性，因此uPA和PAI－1不能预测内分泌治疗的效果。再对其中未接受全身治疗的3 362例淋巴结阴性的亚组分析后发现，uPA和PAI－1是最强有力的预后因素，有助于从这组人群中进一步区分出高或低复发风险的患者。

一项前瞻性多中心随机临床试验Chemo N0纳入556名淋巴结阴性乳腺癌患者，运用酶联免疫吸附法（ELISA）测定肿瘤组织中uPA和PAI－1水平，并以此对患者进行分组，uPA／PAI－1低水平患者的肿瘤复发风险相当低，即使不予全身治疗，5年生存率也超过95%，10年生存率约为90%［9，16－17］。uPA／PAI－1表达高的患者随机分成接受CMF方案化疗组和观察组，随访10年的结果显示，CMF化疗能降低一半的复发风险，结果也肯定了EORTC研究中所提示的uPA／PAI－1水平对化疗疗效的预测价值。这些结果均提示uPA／PAI－1作为反映肿瘤早期侵袭的指标是化疗敏感性的标记物之一，从而有助于临床上制定相关的化疗方案。若采用现在较新的化疗方案，则Chemo N0 10年生存曲线可能会更高。

同时，另一项回顾性研究［15］共入组3 424名早期乳腺癌患者，主要探索肿瘤组织uPA／PAI－1水平（ELISA方法）对化疗和内分泌治疗反应性的影响。经过83个月中位随访后，COX多因素生存分析显示uPA／PAI－1与患者的无病生存率显著相关（P＜0．001，HR＝2．0，95%CI为1．8～2．3）。uPA／PAI－1高水平患者比低水平患者从辅助化疗中获益更多，这个发现与Chemo N0试验中高危患者从CMF化疗更大获益的结论一致。无论从总体还是淋巴结亚组分析上看，化疗效果和uPA／PAI－1水平有明显相关性（P＜0．003，HR＝0．68，95%CI为0．53～0．88）。另外，该研究并未发现内分泌治疗与uPA／PAI－1水平存在显著相关性，uPA／PAI－1水平的高低与内分泌治疗获益并未见明显差异。而其他有关于晚期乳腺癌的研究则提示高表达uPA、uPAR及PAI－1的肿瘤对一线三苯氧胺治疗的反应性较差，从而降低了无进展生存率［18］。这一结果提示我们对尿激酶系统指标的测定有助于从激素受体阳性乳腺癌患者中区分出高危患者，从而采取更为积极的治疗，有助于提高生存率。

uPA／PAI－1水平在临床上为我们提供了肿瘤患者复发风险和治疗反应的参考水准，帮助我们调整乳腺癌患者全身治疗的概念，即根据个体肿瘤生物学特点选择治疗方案。

2005年，国际早期乳腺癌试验者协作组（the Early Breast Cancer Trialists′ Collaborative Group，EBCTCG）提出：除内分泌治疗的效果外，包括蒽环类的化疗方案能使早期乳腺癌15年累计死亡率减少38%（绝经后）和20%（绝经前）［19］。后来一项病例对照研究［20］论证了包括蒽环类的化疗比CMF对uPA／PAI－1高表达乳腺癌效果更好，而对uPA／PAI－1低表达乳腺癌来说疗效没有明显区别。当然，该试验样本量较小且存在交互因素的影响，其结论尚需要其他大样本前瞻性试验的验证。

综上所述，大量回顾性和前瞻性研究都表明uPA／PAl－1能预测淋巴结阴性乳腺癌高复发风险，且能从全身化疗中明显获益。因此，在美国临床肿瘤学 会 （American Society of Clinical Oncology，ASCO）的乳腺癌肿瘤标记物应用指南更新版（2007年）中将uPA／PAI－1列入是乳腺癌患者新的预后指标［21］。最新的一项随机临床试验 NNBC3（Node Negative Breast Cancer 3－Europe）试 图 阐 述 以uPA／PAI－1和／或临床病理因素定义的高低危复发患者对含紫衫类化疗的疗效［22］。该试验目前已完成入组，2 661名患者归为高危组并得到及时化疗，其中1 334名高危患者使用3周期FE100C序贯3周期多西紫杉醇，1327名高危患者使用6周期FE100 C。主要终点事件是无病生存（disease－free survival，DFS），次要终点 事件是 总 生存 （overall survival，OS）。该试验结果将有助于我们进一步从淋巴结阴性患者中区分出高复发风险的患者，并采用可能更为有效的化疗方案。

uPA系统在乳腺癌靶向治疗中的研究进展

由于uPA系统参与了肿瘤侵袭、转移、细胞增殖及血管生成等乳腺癌发展的各个方面，加之所涉及的细胞因子多，作用机制复杂，使得将uPA作为靶点治疗乳腺癌成为目前的研究热点。目前探讨较多的有DNA甲基化、RNA干扰、与uPA抑制相关的细胞因子等。

关于DNA甲基化的研究，主要是基于乳腺癌中uPA基因的表达与其非甲基化状态存在紧密联系这一理论基础。DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）可导致uPA 基因的甲基化及沉默，且抑制浸润性乳腺癌细胞的转移。Pakneshan等［23］将RAS基因转染入乳腺癌细胞MDA－MB－231中，结果发现DNMTl表达被激活，而uPA基因的表达及其活性被抑制，进而使癌细胞的侵袭能力被削弱。由此看出，在很多癌症中刺激肿瘤生长的RAS－DNMT1DNA甲基化路径却对高侵袭乳癌细胞MDAMB231的侵袭力产生了抑制的作用［23］。通过这一机制，在接下来的研究中直接应用S－腺苷－L－蛋氨酸（AdoMet，具有超甲基化及抑制去甲基化作用）处理MDA－MB－231细胞，同样发现癌细胞的uPA表达及侵袭能力明显下降，在动物模型中则表现为肿瘤生长及转移受到抑制，从而也揭示了一条乳腺癌的治疗途径［24］。AdoMet对uPA表达的抑制作用可被去甲基药物5－氮杂胞苷逆转，在Ateeq等［25］的实验中也证实了临床用抗癌药5－氮杂2′－脱氧胞苷（5－aza－CdR）在抑制乳腺癌细胞增殖的同时，还诱导了uPA、趋化因子受体（CXC chemokine receptor4，CXCR4）及转 化 生 长 因 子（transfor－ming growth factorβ，TGF－β）等肿瘤转移基因的表达。

RNA干扰是抗肿瘤研究中的一种常用手段。RAS－细 胞 外 信 号 调 节 激 酶 （extracellular signal regulated kinase，ERK）信号通路的激活 有赖于uPA与uPAR之间的结合，因此uPA与uPAR的RNA干扰不仅抑制uPA和uPAR的表达，同时也抑制了癌细胞增殖［26］。而 Kunigal等［27］则利用pUM（uPA与 MMP－9共同的小干扰RNA质粒载体）转染两种乳腺癌细胞 MDA－MB－231和ZR－75－1，致使uPA 和 MMP－9的表达同时下调，同时MAPK、ERK和AKT（丝裂原活化蛋白激酶、ERK、蛋白激酶B）信号通路分子的磷酸化水平受到抑制，其结果是癌细胞的侵袭及迁移能力明显减弱，细胞增殖降低，动物转移瘤的血管生成减少，甚至完全抑制了裸鼠的原位乳腺癌。目前已有数种RNA干扰药物（如 Bevasiranib、sirna－027）进入临床试验。2008年11月，Wyszko等［28］则报道了第一个应用RNA干扰技术治疗肿瘤（神经胶质瘤）的临床试验，为这项技术应用于临床提供了先例。

近年来发现多种在正常乳腺组织中表达且与uPA抑制相关的细胞因子。乳腺癌转移抑制因子－1可通过抑制核因子－kappaB（NF－κB）的活性，下调uPA乳腺癌细胞中的表达［29］。Maspin是一种特殊的丝氨酸蛋白酶抑制剂，实验证实乳腺癌细胞MDA－MB－231中的 Maspin能下调uPA／uPAR的表达以及uPA的活性，从而减弱其侵袭能力［30］。酪氨酸激酶（Sky）与白细胞特异性激酶（Lck）之间的反应抑制了小鼠中乳腺癌细胞的uPA、MMP－9及VEGF的表达，对乳腺癌的进展有负向调节作用［31］。以上几种细胞因子均在正常乳腺组织中表达，但在乳腺癌组织中沉默，通过对其表达水平的上调，可能发现有效的治疗途径。

结语众多研究表明uPA／PAI－1的过度表达与早期乳腺癌患者的临床预后较差有关，这些研究提示应用这两个因素进行分析，能提示2～8倍的复发和死亡风险［32－33］。更重要的是在淋巴结阴性患者中，这两个指标是独立的预后因素，有助于辅助治疗方案的制定。随着临床上淋巴结阴性患者的比例逐渐升高，uPA／PAI－1状态判定越来凸显其重要性，一方面让我们更为精准地治疗那些真正需要通过辅助治疗提高生存率的患者，另一方面对乳腺癌早期侵袭的靶点治疗研究也提供了治疗失败后的另一个有效方法。靶向治疗的机制主要是干扰uPA系统，抑制uPA／PAI－1的同时抑制乳腺癌的侵袭及转移。对于uPA／PAI－1高表达的早期乳腺癌或许可以联合化疗和靶向治疗，当然，尚需大量前瞻性研究探索最佳化疗方案，何种化疗方案最适合与靶向治疗联用，以及与何种靶向治疗方案连用才能获得较大的获益，同时使不良反应降到最小。

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