天花粉蛋白（TCS）诱导肿瘤细胞凋亡及其抗肿瘤作用机制的研究进展

张 铎（综述） 陶 磊（审校） 路丽明

（复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科 上海 200031）

天花粉蛋白（trichosanthin，TCS）是从葫芦科植物栝蒌的块根中提取出来的相对分子质量（Mr）为27 000的单链核糖体活性抑制蛋白（ribosome inactivating protein，RIP），TCS成熟肽由247个氨基酸残基组成，PI为9．4［1］。临床研究发现TCS具有多种药理学活性，可用于治疗宫外孕、绒毛膜上皮细胞癌、恶性葡萄胎等，对于宫颈癌及白血病等肿瘤也有不同程度的抑制作用［2］。体外研究表明TCS还具有抗病毒（如 HIV），激发调节性 T细胞（regulatory T cell，Treg）及协同进行免疫调节等功效［3－4］。

虽然TCS具有多种药理活性，但其明确的作用机制尚未完全阐明。近年来，对TCS抗肿瘤的作用机制存在多种不同观点，一种观点认为，TCS作为RIP通过不可逆地抑制肿瘤细胞蛋白合成来抑制肿瘤生长；另有研究发现TCS可诱导某些肿瘤细胞凋亡［2－3］；还有研究表明TCS的抗肿瘤作用并非单一途径，而是通过联合作用于肿瘤组织而杀伤肿瘤细胞。研究发现，TCS的作用可能与其剂量有关，高剂量（＞100μg／mL）时，TCS可阻断蛋白质合成；中等剂量（5～50μg／mL）时，TCS可诱导细胞凋亡；低剂量（＜1μg／mL）时，TCS可诱导免疫抑制［5］。本文就近年来TCS抗肿瘤作用机制的研究进展加以综述。

TCS诱导肿瘤细胞凋亡凋亡又称为细胞的程序性死亡（program cell death，PCD），近年来发现多种化疗药物可通过诱导细胞凋亡来发挥药理作用［6］。在研究TCS抗肿瘤作用机制时发现TCS可诱导多种细胞凋亡。黄益玲等［7］研究发现，TCS能诱导人宫颈癌HeLa细胞中包括NOP56、TNFSF10、CASP9、DFFB等在内的62个与凋亡密切相关的基因表达上调；还能诱导包括COL9A3、MGST3、LGALS3BP等在内的16个与细胞黏附及细胞间相互作用相关的基因表达下调，但诱导凋亡的具体途径和过程仍未阐明。

TCS通过依赖cAMP为第二信使的信号途径来诱导细胞凋亡也有观点认为TCS主要通过下调Bcl－2基因来诱导细胞凋亡。Bcl－2属于抗凋亡基因，其表达增高可以维持线粒体内钙稳态，阻止线粒体膜电位下降和线粒体膜通透性转换孔的开放，抑制线粒体释放促凋亡蛋白、Cyto－C和凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF），从而防止细胞凋亡。此外，Bcl－2能结合 Apaf－1和胱天蛋白酶－9（caspase－9），并维持其非活化状态，阻止胱天蛋白酶级联反应，防止细胞凋亡［8］。Wang等［3］研究发现利用环腺苷酸反应元件（cAMP response element，CRE）类似物阻断cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element bound protein，CREB）作用于Bcl－2的基因位点，可以减弱TCS介导的Bcl－2基因表达下降。而p－CREB的过度表达可以上调Bcl－2的表达，在宫颈癌HeLa细胞中这一表达的上调可以被TCS治疗所抑制。由此可以作出推断，TCS诱导细胞凋亡可能是通过CREB介导来下调凋亡抑制基因Bcl－2的表达。另有研究发现，与传统观点认为cAMP激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、进而磷酸化CREB所不同，cAMP同样可以激活PKC，后者作用于蛋白激酶ERK1／2和p38 MAPK，使之转入细 胞核，磷酸化 CREB［9］。Li等［10］发现TCS诱导凋亡的机制可能通过PKC起作用，因为使用PKC激动剂会使TCS的作用下调；反之，应用PKC抑制剂会协同TCS的作用。［35S］GTPγS结合序列分析表明，TCS可以活化JAR细胞和K562细胞表面的G蛋白，进而通过G蛋白来调节腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）的活性，Li等［11］研究发现TCS和高浓度的AC抑制剂都可通过剂量和时间依赖的方式来降低HeLa细胞内的cAMP水平，因此活化的抑制性G蛋白（Gi）参与了TCS诱导的凋亡。由此推测，TCS作用于抑制性Gi，抑制AC下调cAMP，从而抑制PKC活化，并通过p38MAPK和ERK1／2信号通路下调CREB磷酸化，下调Bcl－2等与凋亡抑制有关基因的表达，从而诱导凋亡。

TCS通过线粒体途径诱导细胞凋亡TCS诱导凋亡的过程可以通过直接作用于线粒体而发生。Li等［12］研究发现，TCS可以诱导人前髓细胞HL－60发生凋亡，作用过程中发现TCS使线粒体膜的通透性发生改变，接着从线粒体到细胞胞质释放细胞色素c和Smac，活化caspase－9，促进凋亡复合物的形成，进而通过线粒体途径诱发细胞凋亡。同时发现，使用caspase－9抑制剂z－LEHD－FMK 时，细胞的凋亡进程被阻断，说明caspase－9启动的线粒体途径参与到TCS诱导的凋亡［12］。此外，在研究TCS诱导细胞凋亡作用机制的过程中发现，使用Fas单克隆抗体不会阻止TCS诱导的细胞凋亡。由此证明，TCS不是通过死亡受体途径，而是通过进入细胞内促发线粒体途径而诱导细胞凋亡［11－12］。此外，一些学者通过形态学观察揭示了TCS线粒体凋亡通路。研究TCS作用于视网膜时发现，TCS可以选择性地进入并摧毁Müller细胞及色素上皮细胞，而对其他神经胶质细胞的作用轻微。TCS作用的视网膜细胞出现了核碎裂和核溶解，并出现了特征性的凋亡小体以及膨胀的线粒体。这些发现表明，TCS通过诱导细胞凋亡而发挥作用，而胀大的线粒体说明其凋亡过程可能依赖于线粒体［13］。

TCS通过影响细胞骨架来诱导细胞凋亡凋亡的主要形态学特征为表面微绒毛消失、细胞皱缩、胞质出泡形成凋亡小体。在核酸水平上，凋亡还可表现为核碎裂和核溶解。此外，凋亡还与细胞表达微管（microtubules，MT）、微丝（microfilaments，MF）的变化有关。Wang等［14］的研究还发现TCS诱导凋亡的过程中，解聚的MF在靠近细胞核和凋亡小体附近的粗糙细胞膜上堆积，紧接着在胞质膜下有MT形成环状结构，由此可见TCS诱导的HeLa细胞凋亡和细胞重组高度协调。在生理条件下，MF维持质膜的完整性，凋亡过程中，MF解聚，MT对于维持质膜的完整起到了重要的作用，TCS诱导的细胞凋亡末期出现的环状MT预示着细胞从凋亡向坏死过程的演进［11］。同时研究还发现，在TCS诱导细胞凋亡的过程中，肌动蛋白和微管蛋白基因受到了不同程度的调控——γ肌动蛋白mRNA下降速度快于β肌动蛋白，α和β微管蛋白mRNA在Hela细胞凋亡的晚期依次下调。这些结果都表明，TCS诱导的HeLa细胞凋亡伴随着特殊的细胞骨架结构的改变，同时肌动蛋白和微管蛋白基因在细胞凋亡的不同阶段表达受到抑制［14］。然而，TCS是否通过MF和MT影响细胞骨架来启动细胞凋亡，还有待进一步研究探索。

TCS作为RIP发挥抗肿瘤作用RIP具有RNA N－C糖苷酶活性，能水解真核细胞核糖体28SrRNA的4324位上腺苷酸的N－C糖苷键，释放出1个腺嘌呤碱基，使核糖体不可逆失活，从而抑制蛋白质合成。RIP可以分为2种类型：Ⅰ型RIP由单链组成，仅具有核糖体抑制活性，TCS是典型的Ⅰ型RIP；Ⅱ型RIP由2条多肽链组成，分别称为A链和B链，A链从结构及功能上均与Ⅰ型RIP相似，B链具有凝集素样结构，可特异地与真核细胞表面的半乳糖受体结合，有利于RIP进入细胞，其代表植物蛋白是蓖麻素蛋白（ricinus communis agglutinin，RCA）［15］。

TCS的选择性作用机制Sha等［15］将RCA的A链与TCS对照研究时发现，体外TCS的毒性远低于RCA；体内较小剂量的RCA就会引起坏死和炎症，而TCS即使是较大剂量，也仅是引起视网膜细胞凋亡。Sha等［13］研究发现RCA毒性很强，对于哺乳动物细胞的杀伤几乎不具有选择性。相反，TCS通常具有选择性，其毒性作用主要针对来源于滋养层细胞的绒毛膜癌及来源于骨髓造血干细胞的各种白血病，而对正常组织及其他组织的毒性较弱。TCS这一选择性有利于其应用于临床，而TCS选择作用的机制可能与其进入细胞的途径相关。

目前研究发现TCS可通过两条途径进入到细胞内而发挥细胞毒性作用：其一，通过TCS与磷脂膜相互作用进入细胞内；其二，通过受体介导的内吞作用，受体主要是低密度脂蛋白受体相关蛋白（lowdensity lipoprotein receptor related protein，LRP）［16］。Jiao等［17］研究发现，TCS通过绒毛膜细胞表面的JAR和BEWO细胞上的LRP1内吞进入到靶细胞内而发挥作用。而在HeLa细胞表面未发现LRP1，这可以解释为什么HeLa细胞相比于JAR和BEWO细胞对TCS不敏感，可能是因为HeLa细胞不能通过有效的内吞途径来摄取TCS。Li等［18］还发现，胃癌SGC－7901细胞相比于正常的胃黏膜上皮细胞对TCS更敏感；研究同时发现TCS诱导的细胞毒性在肝HepG2细胞上不如在JAR细胞上明显，其机制可能也与LRP1介导的受体内吞有关。Zhao等［19］研究TCS抗HIV作用机制时发现，与RCA通过Sec61蛋白孔进入细胞内质网不同，TCS能直接穿过内质网膜。TCS通过膜表面的脂质进入，HIV－1包膜上存在大量脂质，因此可以确信TCS通过上述途径进入HIV－1内发挥作用。TCS通过非特异性受体进入细胞发挥作用的研究解释了TCS可特异性作用于肿瘤等靶细胞和靶组织，而对于正常组织和其他组织无作用。但仍存在一些疑问，如受体介导的内吞为什么可以躲过溶酶体的作用；一些正常的人体组织细胞表面有大量LRP1，但为什么对TCS同样不敏感，这些问题有待于进一步研究探索。

TCS抑制蛋白质合成与其诱导细胞凋亡之间的关系早期认为TCS具有N－糖苷酶活性，可以阻断蛋白质合成，后又发现其可诱导细胞凋亡。两者之间是否存在相关性尚不明确［11］。在研究其他RIP诱发细胞凋亡机制的过程中发现，RIP的N－糖苷酶活性可以介导核糖体毒性应激反应（ribotoxic stress response，RSR），从而激活 SAPK／JKN 和p38信号通路，最终诱发细胞凋亡［20］。然而之前有研究报道，TCS 可以抑制 PKC／ERK1／2 和 p38 MAPK信号通路，导致HeLa细胞的生长抑制［9］。由此推断，TCS可能并未参与RSR，也没有通过N－糖苷酶活性来诱导细胞凋亡。在TCS诱导人前髓细胞HL－60发生凋亡的过程中，TCS处理1．5h后发生线粒体膜通透性改变，但其是否发生在蛋白质合成的抑制之前尚不明确［11］。

TCS的其他抗肿瘤作用机制最近研究发现TCS可以用于治疗慢性髓细胞性白血病。慢性髓细胞性白血病的特征为染色体t（9；22）发生相互易位，称为费城染色体。其中Bcr－Abl基因发生了融合，融合基因的转录和翻译持续激活了原癌基因p210 Bcr－Abl，也导致了ABL酪氨酸激酶的活性失去控制。甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate，IM）是一种酪氨酸酶阻断剂，也是治疗慢性髓细胞性白血病最有效和最特异的药物。然而临床研究表明，IM不能完全清除恶性瘤变，而且长期使用的患者会对IM产生抵抗。TCS可以协同IM来诱导K562细胞生长停滞。这一作用可以理解为TCS抑制融合基因Bcr－Abl转录表达的酪氨酸激酶，并且下调原癌基因p210 Bcr－Abl水平，抑制如PKC和NF－κB等一些信号分子。而PKC和NF－κB广泛参与细胞的增殖及其调控［21］。一些研究发现，使用NF－κB的抑制剂（如地塞米松）可以增强TCS诱导细胞凋亡的作用，由此推测NF－κB进入细胞核内可以上调一些抗凋亡基因（如Bcl－2）［18］。

此外，在研究TCS、米非司酮、顺铂在卵巢恶性肿瘤治疗中的作用机制时发现，与顺铂和米非司酮不同，TCS的抗肿瘤作用机制之一是能够明显下调肿瘤组织中 HLA－G 和 HLA－E的表达水平。HLA－G和HLA－E是非经典HLA－Ⅰ分子，它们在肿瘤组织表面表达的上调可以抑制T细胞和NK细胞对于肿瘤组织的杀伤作用，从而使肿瘤组织逃过机体的免疫监视作用［22］。

结语TCS可以通过多种途径来杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长，一方面可以发挥RIP活性，另一方面诱发肿瘤细胞的凋亡，此外还可以通过其他多种途径来抑制肿瘤细胞的生长。然而，在TCS的研究过程中尚存在一些问题有待解决。例如，TCS发挥的RIP活性与其诱发肿瘤细胞凋亡之间的关系，如何通过对TCS的结构进行修饰来提高其生物活性并降低过敏原性，TCS诱导凋亡的通路等。相信随着这些问题的解决，TCS可以更好地应用于临床抗肿瘤的治疗与研究。

［1］ Shaw PC，Chan WL，Yeung HW，et al．Minireview：trichosanthin—aprotein with multiple pharmacological properties［J］．Life Sci，1994，55（4）：253－262．

［2］ 金毓翠，李承慧，刘锦霞．结晶天花粉羊膜腔注射用于中期妊娠引产的临床分析［J］．生殖与避孕，1985，5（1）：15－17．

［3］ Wang P，Xu J，Zhang C，et al．CREB，apossible upstream regulator of Bcl－2in trichosanthin－induced HeLa cell apoptosis［J］．Mol Biol Rep，2010，37（4）：1891－1896．

［4］ Zhou H，Jiao Z，Pan J，et al．Immune suppression via IL－4／IL－10－secreting T cells：a nontoxic property of anti－HIV agent trichosanthin［J］．Clin Immunol，2007，122（3）：312－322．

［5］ Wang B，Jiao Z，Shao X，et al．Phenotypic alterations of dendritic cells are involved in suppressive activity of trichosanthin－induced CD8＋CD28－regulatory T cells［J］．J Immunol，2010，185（1）：79－88．

［6］ Ping Y，Yang－XF．Targeting apoptotic and autophagic pathways for cancer therapeutics［J］．Cancer Lett，2011，300（2）：105－114．

［7］ 黄益玲，胡火军，黄利鸣，等．天花粉蛋白诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的分子机制研究［J］．中国药理学通报，2007，23（1）：99－101．

［8］ 肖献忠．病理生理学［M］．第1版．北京：高等教育出版社，2004：103－105．

［9］ Wang P，Chen L，Yan H．Trichosanthin suppresses HeLa cell proliferation through inhibition of the PKC／MAPK signaling pathway［J］．Cell Biol Toxicol，2009，25（5）：479－488．

［10］ Li J，Xia X，Nie H，et al．PKC inhibition is involved in trichosanthin－induced apoptosis in human chronic myeloid leukemia cell line K562［J］．Biochim Biophys Acta，2007，1770（1）：63－70．

［11］ Li M，Li X，Li JC．Possible mechanisms of trichosanthininduced apoptosis of tumor cells［J］．Anat Rec（Hoboken），2010，293（6）：986－992．

［12］ Li J，Xia X，Ke Y，et al．Trichosanthin induced apoptosis in HL－60cells via mitochondrial and endoplasmic reticulum stress signaling pathways［J］．Biochim Biophys Acta，2007，1770（8）：1169－1180．

［13］ Sha O，Yew DT，Cho EY，et al．Mechanism of the specific neuronal toxicity of a type I ribosome－inactivating protein，trichosanthin［J］．Neurotox Res，2010，18（2）：161－172．

［14］ Wang P，Li JC．Trichosanthin－induced specific changes of cytoskeleton configuration were associated with the decreased expression level of actin and tubulin genes in apoptotic Hela cells［J］．Life Sci，2007，81（14）：1130－1140．

［15］ Sha O，Yew DT，NG TB，et al．Different in vitro toxicities of structurally similar type I ribosome－inactivating proteins（RIPs）［J］．Toxicol In Vitro，2010，24（4）：1176－1182．

［16］ 黄益玲，黄利鸣．天花粉蛋白的构效关系及进入细胞的途径［J］．时珍国医国药，2010，2l（2）：268－269．

［17］ Jiao YZ，Liu W．Low－density lipoprotein receptor－related protein 1is an essential receptor for trichosanthin in 2 choriocarcinoma cell lines［J］．Biochem Biophys Res Commun，2010，391（4）：1579－1584．

［18］ Li M，Chen F，Liu C．P，et al．Dexamethasone enhances trichosanthin－induced apoptosis in the HepG2hepatoma cell line［J］．Life Sci，2010，86（1－2）：10－16．

［19］ Zhao W，Feng D，Sun S，et al．The anti－viral protein of trichosanthin penetrates into human immunodeficiency virus type 1［J］．Acta Biochim Biophys Sin，2010，42（2）：91－97．

［20］ Nrayangnan S，Surendranath K，Bora N，et al．Ribosome inactivating proteins and apoptosis［J］．FEBS Lett，2005，579：1324－1331．

［21］ Zhang K，Xu J，Huang X，et al．Trichosanthin downregulated p210Bcr－Abl and enhanced imatinib－induced growth arrest in chronic myelogenous leukemia cell line K562［J］．Cancer Chemother Pharmacol，2007，60（4）：581－587．

［22］ 王建英，许茜，吴淑娟，等。药物对卵巢癌裸鼠移植瘤组织中 HLA－G和 HLA－E表达的影响［J］．河北医药，2009，31（21）：2878－2880．