间充质干细胞治疗椎间盘退行性变的研究进展

李 超，李 明

腰痛是临床常见病之一，据统计约有85%的人一生中会出现该症状，是45岁以上的人丧失劳动能力的主要原因之一。椎间盘退行性疾病(disc degeneration disease，DDD)是腰痛主要的原因之一。传统的脊柱融合的治疗方法能够有效地缓解疼痛，但会导致脊柱活动度的下降和邻近椎间盘的退变。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植治疗腰椎退行性疾病作为新型的治疗手段，与传统方法相比有很多优势，在基础与临床研究方面都取得了很大的进展。

1 DDD的病理改变

DDD作为与年龄密切相关的疾病，目前的确切病因尚不清楚。各种病因，如年龄、遗传因素、吸烟等［1］共同作用，导致了椎间盘的病理变化。①细胞种类的改变:终板多由圆形的软骨样细胞构成，而纤维环多由狭长的软骨样细胞构成，这两部分的细胞成分较少变化。未成熟的髓核中存在部分脊索细胞，相对于其他细胞而言，有着更强的分泌蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的能力，随着年龄的增长(约4～10岁)逐渐被软骨样的细胞替代，脊索细胞的消失被认为是椎间盘退变的重要原因之一［2］。②细胞老化坏死与细胞凋亡:Le Maitre等［3］发现在退化的椎间盘中P16INK4A，β半乳糖苷酶等细胞老化的标志物表达上升，同时细胞的增值能力下降。随着细胞的老化与营养供应的不足，椎间盘的微环境出现变化，包括氧分压、PH值、自由基的增加等［4］，微环境的改变诱导了细胞的坏死与凋亡。据报道，退变的椎间盘坏死的细胞比例可高达50%［5］。③细胞表达的变化:退变的椎间盘细胞蛋白合成结构与生长因子等均发生了改变，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型胶原纤维与白细胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-1-RI含量的增加，Ⅱ、Ⅸ型胶原纤维、蛋白聚糖、IL-1-Ra含量的降低［6］，细胞外基质表达减少。特别是Ⅰ/Ⅱ型胶原蛋白比例的上升和蛋白聚糖、基质含量的减少，被认为是DDD特征性的病理变化之一。上述细胞组织在病理状态下的改变最终导致椎间盘水含量的降低，凝胶状髓核逐渐干裂，加之外层纤维环张力的下降，最终导致了椎间盘高度的下降、纤维环的破裂和髓核的疝出。

2 MSC的特点

MSC是来自于未成熟的胚胎结缔组织的多能干细胞，在体内或体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。在人的骨髓中，MSC的密度约为百万分之一到万分之一，其免疫表型表现为CD29+，CD44+，CD71+，CD90+，CD106+，CD14－，CD4－，CD45－，HLA-Ⅱ阴性。MSC移植应用于治疗DDD有其自身的优势:①MSC来源广泛，存在于骨髓、脂肪等间质组织，相对于自身椎间盘髓核细胞(nucleus pulposuscell，NPC)移植而言，其提取不会损伤椎间盘，易于提取和培养增殖。②退化的椎间盘中的组织基因表达改变，合成Ⅱ型胶原与蛋白聚糖的能力下降，MSC不存在此问题。③MSC存在自我复制和分化的能力，相对于成熟细胞，MSC更易于诱导分化。④MSCHLA-Ⅱ型抗原阴性，免疫反应较弱，为同种异体移植提供了可能。

3 MSC分化的诱导

3.1 生物支架

生物支架能够模拟椎间盘的微环境，提高MSC移植效率。Merceron等［7］提出生物支架必须兼备生物组织相容性，体内降解能力，三维的内部构像，合适的机械强度等条件。目前常用的有藻酸盐凝胶、聚氨基葡萄糖凝胶、藻酸丙二醇酯、胶原海绵等多种，哪种支架能够提供最佳的生物学效果目前尚无定论［4］。Gruber等［8］对比了胶原海绵、胶原凝胶、琼脂糖、藻酸盐，发现胶原海绵支架有着良好的诱导细胞增殖与基因表达能力，但是尽管胶原凝胶支架中的细胞增殖能力最强，其合成基质的能力较低，限制了其应用。Richardson等［9］报道了复合左旋乳酸支架能够诱导MSC向椎间盘中NPC分化，随后的研究发现壳聚糖-甘油磷酸酯凝胶可诱导MSC向软骨样细胞分化，并表达胶原与蛋白聚糖。Vinatier等［10］通过动物实验证实了水凝胶类支架有着良好的效果，其诱导效果与其他支架相近，其可注射的特点使其在临床应用中有着更广阔的前景。

3.2 MSC培养的微环境

正常人体组织中椎间盘的环境可以诱导MSC细胞向NPC分化，其作用与通过胶原等大分子和MSC膜表面的信号通路接触有关，目前认为NPC的存在可以诱导MSC细胞向NPC分化，而MSC也可促进NPC自身的修复与表达。Allon等［11］将 MSC与NPC共同培养，发现MSC在保持自身数量的同时存在向软骨样细胞分化的现象，其结构全部为外层的软骨样细胞包裹内层的MSC细胞，并在培养基中呈微卫星放射样分布。Sobajima等［12］将MSC与NPC按照不同的比例混合培养，发现NPC与MSC比例为75∶25或50∶50时培养基产生的细胞外基质含量最高。MSC培养的物理环境，如低氧、PH值等可诱导MSC向能够分泌蛋白聚糖及基质的软骨样细胞分化。Felka等［13］通过MSC的体外培养发现低氧能够诱导MSC向软骨样细胞分化，并增加细胞外基质的分泌。Wuertz等［14］提取兔MSC在体外培养，发现酸性环境可抑制MSC的分化与增殖。

3.3 细胞因子

细胞因子可以调节MSC的增殖、分化和基质的合成［15］，Steck 等［16］提取人 MSC 在含转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGT-β)藻酸盐培养基中培养，发现TGF-β可促进MSC表达转录因子9分泌，并提高胶原与聚糖蛋白的表达。Yang等［17］将54只椎间盘损伤模型兔随机分为3组，分别予纤维凝胶-MSC-TGF-β1、纤维凝胶-TGF-β1 及空白对照处理，发现第1组可有效减缓兔椎间盘退变。IGF-1可以诱导MSC向软骨组织的分化，Ehlicke等［18］在体外以不同细胞因子诱导MSC向NPC分化3周，以荧光免疫法检测结果，发现胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、成纤维生长因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)，血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)有诱导MSC分化与基质合成的作用。Shen等［19］以 TGF-β3 同骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)诱导MSC分化，发现TGF-β3明显增加蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达，而这一作用可被BMP-2加强。Chiou等［20］的研究发现FGF-2可能通过MAPK信号旁路诱导MSC向软骨样细胞分化。Imai等［21］将人NPC在含重组人成 骨 蛋 白-1(recombination human osteegenic protein-1，rhOP-1)培养基中培养14 d，发现rhOP-1可促进细胞增殖与产物表达。在MSC与NPC共培养的过程中，MSC与NPC可相互促进这些细胞因子的分泌，并以此诱导MSC向NPC分化、NPC的增殖及产物的表达。

4 MSC体内植入研究

Zhang等［22］报道了MSC与髓核细胞混合培养后植入山羊椎间盘退变模型中，经过6个月后发现实验组椎间盘中蛋白聚糖浓度较对照组(只注入培养基)高45%。Yang等［17］将家兔椎间盘退变模型分为MSC-TGF-β1联合注入组，单纯 TGF-β1注入组和空白组，结果显示相对于单纯TGF-β1注入组，MSC有效减缓椎间盘退变，胶原及蛋白多糖的积聚明显多于空白组与单纯 TGF-β1注入组。Sakai等［23］在家兔退变椎间盘模型制成2周后，分别移植入MSC，24周后检查正常椎间盘、模拟手术椎间盘和移植后椎间盘的X线片椎间盘高度、MRI T2信号的改变，组织学、免疫组织化学和基质关联的基因表达。结果显示移植MSCs组椎间盘的高度为正常对照组的91%、T2信号强度为正常对照组81%，免疫组织化学和基因表达分析有蛋白多糖积聚。而模拟手术椎间盘只有正常对照组的61%和60%。Crevensten等［24］将白鼠异体MSC以透明质酸凝胶为支架注入尾骨椎间盘内，单独注射凝胶为对照组。2周后以免疫荧光法可观察到存活MSC细胞，4周后发现实验组椎间盘较对照组有增高趋势。Sobajima等［12］以 β-半乳糖苷酶标记兔 MSC，分别注入12只兔L2/L3/L4/L5髓核内，在3周、6周、12周及24周观察干细胞情况，发现24周时MSC存活良好，未发现不良反应，并且在周围纤维环中观测到MSC的存在。Wang 等［25］对猕猴 L3/L4、L5/L6椎间盘摘除术后，随机分组做陶瓷椎间盘、自体髂骨移植融合及骨髓MSC陶瓷混合融合等3种替代治疗，3个月分析融合及基质、胶原产生情况，结果显示混合组融合最佳，相对于其他2组胶原与蛋白聚糖的积累有显著差异。Hiyama等［26］将犬分为不作处理对照组，髓核摘除组和MSC组，其中MSC组在髓核摘除4周后给予MSC注入，12周后观察结果，发现MSC组椎间盘退变较其他组缓慢，其作用可能是通过表达人凋亡相关因子配体以维持髓核免疫豁免状态。Yang等［27］将异体鼠MSC注入鼠退变椎间盘内，观察12周，发现NPC蛋白聚糖基因表达上调，而原位杂交与免疫组化分析可发现MSC向NPC分化的现象，证实MSC可通过分化与增殖为NPC并促进NPC产物表达在体内发挥其保护椎间盘的作用。Henriksson等［28］将椎间盘退变猪分为2组，分别给予人MSC与人MSC-水凝胶，在1个月、3个月和6个月观察，MRI发现所有椎间盘均出现退变，但人MSC-水凝胶组退变较慢，证实水凝胶类在机体内仍可发挥其促进MSC分化与基因表达的作用，同时探讨了异种MSC用于治疗DDD的可能性。Wei等［29］将荧光标记人MSC分为CD34+组与CD34－组注入鼠尾骨椎间盘，42 d后发现MSC存活情况良好，在21 d后发现CD34－组MSC存在向NPC分化现象，而CD34+无此现象，且在所有椎间盘内均无炎细胞的聚集，证实异种MSC可存活、分化、表达且有免疫豁免。由于MSC治疗DDD开展时间相对较短，其安全性尚有待进一步验证，临床报道的人体实验很少。Yoshikawa等［30］报道了2名腰椎椎管狭窄合并椎间盘退行性变的病例，在髂骨取MSC在体外含自体血清的培养基增殖后，以胶原海绵为支架植入退化椎间盘内，2年后行MRI检查，椎间盘无退化迹象。

应用MSC治疗DDD，针对病因治疗，避免了传统治疗手段脊椎活动受限、相邻节段椎间盘退变等并发症，在动物实验中已取得了良好的效果，拥有广阔的临床应用前景［31］。然而，还有许多问题亟待解决:①细胞因子与髓核细胞诱导MSC分化的机制及分子生物学基础尚不明确。②缺乏严密设计的人体相关试验，临床安全性未得到评估。③MSC移植作为治疗手段，在临床应用的时机有待确定。相信在医务工作者的不懈努力下，这些问题不日将得到解决，MSC将在治疗椎间盘退变性疾病方面发挥更大的作用。

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