喜炎平注射液细菌内毒素检查法的建立

吴寒寅，孟德胜

(中国人民解放军第三军医大学第三附属医院野战外科研究所药剂科，重庆 400042)

喜炎平是穿心莲内酯的提取物，可清热解毒、抗病毒，且疗效确切、副作用小，目前广泛应用于治疗上呼吸道感染[1]。其质量标准规定采用家兔进行热原学检查[2]，但该法操作烦琐，对实验动物要求较高，检测费用大。本试验根据2010年版《中国药典(二部)》[3]和2010年版《中国药品检验标准(操作规程)》细菌内毒素检查法[4]进行试验，建立喜炎平注射液的细菌内毒素检查法。

1 仪器与试药

XW－80A型涡轮混合器(上海医科大学仪器厂);BHW－2型恒温水浴锅(北京医疗设备厂);微量移液器(上海求精生化试剂仪器有限公司，50 ～250 μL，200 ～1 000 μL)。细菌内毒素工作标准品(批号为080301，规格为10 EU/支);细菌内毒素检查用水(WBET，批号为100602，规格为5 mL/支，细菌内毒素含量低于0．015 EU/mL，生产厂家为厦门鲎试剂厂有限公司);鲎试剂(TAL，批号为 1006251，灵敏度为 0．125 EU/mL，规格为 0．1 mL，湛江安度斯生物有限公司);鲎试剂(TAL，批号为100406，灵敏度为 0．125 EU/mL，规格为 0．1 mL，厦门鲎试剂厂有限公司)。喜炎平注射液(规格为 2 mL∶50 mg/支，批号分别为 20091203，20100603，20100628，江西青峰药业有限公司)。

2 方法与结果

2．1 TAL灵敏度复核

按2010年版《中国药典(二部)》附录“细菌内毒素检查法”规定，进行TAL的标示灵敏度复核，结果见表1。两批鲎试剂灵敏度的测定值(λc)均在 0．5 λc～2．0 λc之间，表明鲎试剂灵敏度符合复核规定，可以用于细菌内毒素检查。

2．2 细菌内毒素限值(L)的确定

根据细菌内毒素限值(L)=K/M，式中M为人用每千克体重每h最大剂量，按药品说明书规定，可知其最大用量为500 mg(20 mL)/次，每日 1 次，则M=20 mL/60 kg·h=0．33 mL/kg·h，L=5 EU·kg－1·h－1/0．33 mL·kg－1·h－1=15 EU/mL，根据《中国药典》[4]，适当调整限值，即提高到计算限值的2～3倍，最终确定细菌内毒素限值为5 EU/mL。

表1 TAL灵敏度复核试验结果

2．3 最大有效稀释倍数(MVD)确定

MVD=CL/λ =5/0．125=40倍。

2．4 供试品干扰预试验

干扰预试验:为确定喜炎平注射液对细菌内毒素检查法不造成干扰的浓度，在干扰试验前首先进行干扰预试验。用BET水将喜炎平注射液稀释成 1 ∶5，1∶10，1 ∶20，1 ∶40，将此 4 个浓度的供试品和原液共5个梯度浓度作为NPC系列;同时在每个浓度中加入2．0 λ的内毒素标准品做PPC系列，每一浓度平行做2支。另取2支加入BET水作为阴性对照，2支加入2．0 λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照，结果见表2。可知，喜炎平注射液稀释到40倍时，对鲎试剂与内毒素的反应无干扰，为进一步验证，进行如下正式干扰试验。

表2 样品干扰预试验结果

调pH后的干扰预试验:将喜炎平注射液用0．1 mol/L NaOH调 pH 至适合反应的最佳 pH 范围 6．0～8．0，其他操作按 2．4．1项下方法进行，结果表明，喜炎平注射液经用0．1 mol/L NaOH调pH至6．0～8．0后细菌内毒素试验结果与调pH前相同。

2．5 正式干扰试验

正式干扰试验:将3批喜炎平注射液用细菌内毒素检查用水进行稀释，使其最终稀释倍数为40倍，使用2个厂家灵敏度均为0．125 EU/mL的鲎试剂。将供试品稀释液和BET水将同一支细菌内毒素工作标准品，稀释制成含细菌内毒素工作标准品2．0，1．0，0．5，0．25 λ 4 种浓度的内毒素溶液。每一浓度平行做 4 管，另取BET水和供试品稀释液各2支阴性对照管。结果见表3。可知，当喜炎平注射液稀释至40倍时，最大浓度2．0 λ管均为阳性，最低浓度0．25 λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性。其Es=antilg(∑X/4)=0．125 EU/mL，Et测定值均在 0．5Es～2．0Es，故喜炎平注射液稀释至40倍后对细菌内毒素检查法不形构成干扰。

调pH后的正式干扰试验:取喜炎平注射液经用0．1 mol/L NaOH 调 pH 至 6．0～8．0后其他操作按 2．5．1项下方法进行，结果表明，喜炎平注射液经用0．1 mol/L NaOH调pH至6．0～8．0后，反应结果与调pH前一致。

表3 干扰试验结果

2．6 样品细菌内毒素检查

取3批喜炎平注射液，分别稀释至40倍，使用2个厂家灵敏度为0．125 EU/mL的鲎试剂按2010年版《中国药典(二部)》附录进行细菌内毒素检查试验，结果见表4。可知，供试品管和阴性对照管均呈阴性，供试品阳性对照和阳性对照管均呈阳性，3个批号供试品细菌内毒素检查均符合规定。

表4 样品细菌内毒素检查结果

3 讨论

细菌内毒素检查法最适宜的pH为6．0～8．0，虽然TAL有一定的缓冲能力，但对pH过高或过低的溶液缓冲能力有限，都将影响TAL灵敏度及内毒素的活性，可能是导致试验结果重现性差的重要原因，而在样品中加入确定量的酸碱预先中和后再稀释，可减少干扰。由本试验可知，将喜炎平注射液稀释至40倍(质量浓度为1．25 g/L)时，样品对细菌内毒素检查法不构成干扰，用标示灵敏度为0．125 EU/mL的鲎试剂可用于样品的细菌内毒素检查。该方法操作简单、安全可靠。在干扰试验前增加干扰预试验，是为了初步判断喜炎平注射液对细菌内毒素检查法不构成干扰的稀释倍数，如果预试验在40倍稀释是无法排除干扰，则应该考虑使用更高灵敏度的鲎试剂，进行更大倍数稀释进行试验。

[1]李晓菊，季红英．中药注射剂喜炎平的不良反应12例临床分析[J]．中外医疗，2009(34):107．

[2]WS－108637W(ZD－0863)－2002，国家食品药品监督管理局标准(试行)[S]．

[3]国家药典委员会．中华人民共和国药典(二部)[M]．北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅪE，附录ⅩⅨM．

[4]周国斌．《中国药品检验标准(操作规程)》[M]．北京:中国卫生出版社，2010:330－343．