东北地产轮叶党参生药鉴定与高效液相色谱指纹图谱研究

陈恒冲，马彬峡，李景辉

(1．辽宁省本溪市药品检验所，辽宁 本溪 117000;2．辽宁省本溪市卫生学校，辽宁 本溪 117000)

轮叶党参为桔梗科党参属植物轮叶党参Codonopsis lanceolataBenth．et Hook的干燥根，又名羊乳、山胡萝卜、四叶参等，是药食兼用的中药材，具有补气养阴、润肺生津、消肿排脓及解毒疗疮之功效[1]，主要分布于我国的东北三省及华北、华南和长江中下游地区，日本、朝鲜及俄罗斯等地也有分布。近年来，东北地区人工栽培面积逐年增加，主要出口东南亚的一些国家和地区，市场前景广阔。到目前为止，轮叶党参药材质量标准尚未被《中国药典》及我国各地方中药材质量标准收载，对其性状及显微特征研究的报道较少[2]。在此深入研究了轮叶党参的性状及显微特征，并建立了东北地产药材的高效液相指纹图谱，现报道如下。

1 仪器与材料

日本岛津Shimadzu LC－10AT型高效液相色谱仪，Shimadzu SPD－10A型紫外检测器，anstar色谱工作站，AE100型电子分析天平(瑞士梅特勒)。水(二次重蒸水，自制)，乙腈(山东禹王实业有限公司禹城化工厂)为色谱纯，甲醇(沈阳新兴试剂厂)。齐墩果酸对照品购自中国药品生物制品检定所(批号为110709－200505);轮叶党参皂苷对照品由本实验室自制，经HPLC面积归一化法测定纯度在98%以上。轮叶党参药材共计10批，分别采自辽宁东部地区与吉林延边地区，均经辽宁省本溪市药品检验所刘凤云主任中药师鉴定，编号、产地见表1。

表1 相似度计算结果

2 方法与结果

2．1 性状鉴别

本品呈圆锥形或纺锤形，有的有分枝，扭曲不直，长6～15 cm，直径2～6 cm。表面灰棕色至棕褐色，顶端有多数疣状突起的茎痕及芽，每个茎痕呈圆形凹陷，根的上部有致密的横环纹，向下渐稀疏而粗，全体有纵皱纹，粗糙不平，质硬而脆，断面略平坦，多裂隙，形成层环明显，木部黄色，皮部类白色。气微，味甜而苦。

2．2 显微鉴别

横切面显微特征:木栓细胞10余列，外侧4～9列为石细胞，石细胞长方形、类方形或多角形，切面排列，壁稍厚，纹孔及孔沟稀疏;栓内层狭窄;韧皮部宽广，外侧多裂隙，筛管散列，大多与乳管群伴生，乳汁管内含黄棕色微颗粒状物;形成层不成环;木质部导管稀疏，单个散在或2～3成群放射状排列;木射线宽广。

粉末显微特征:石细胞较多，成群存在，长方形、类方形或类多角形，细胞壁增厚不显著，纹孔稀疏，孔沟不明显，直径76～145 μm;木栓细胞类长方形、类方形，切面观排列较整齐;乳管相互联结成网状，直径15～24 μm，内含油滴状物及颗粒状物;木薄壁细胞淡黄色，类方形或长方形，细胞壁显著增厚，3年生以上药材呈连珠状，直径132～246 μm，有横隔;主为网纹导管，直径18 ～43 μm;有菊糖。

2．3 HPLC指纹图谱研究

2．3．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agilent TC－C18柱(250 mm×4．6 mm，5 mm);流动相:以乙腈为流动相 A，以0．15%磷酸为流动相 B，梯度洗脱(0～20 min，11%A→16%A;20～35 min，16%A→28%A;35～60 min，35%A→60%A);检测波长:207nm;柱温:30℃;流速:1．0 mL/min;进样量:20 μL。所有组分在60 min内出峰完毕，理论板数按齐墩果酸色谱峰计算不低于10 000，齐墩果酸与相邻色谱峰之间的分离度大于 1．5。

2．3．2 溶液制备

取本品粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，精密加入甲醇100 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，用甲醇补失质量，滤过，精密量取续滤液50 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，0．45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密称取齐墩果酸[3]对照品5．25 mg，轮叶党参皂苷[4]对照品5．06 mg，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL，置于另一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成混合对照品溶液。

2．3．3 方法学考察

精密度试验:取8号样品，按2．3．2项下操作，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱。结果表明，各色谱峰对内参比峰的相对保留时间和相对峰面积的比值基本一致(RSD为0．7% ～2．3%)，符合指纹图谱要求。

重现性试验:取同一样品(8号)5份，精密称定，按2．3．2项下操作，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱。结果表明，各色谱峰对内参比峰的相对保留时间和相对峰面积的比值基本一致(RSD为1．1% ～2．8%)，符合指纹图谱要求。

稳定性试验:取精密度试验项下溶液，按上述色谱条件，分别在 1，4，8，16，24 h 时进样分析，记录指纹图谱。结果表明，各色谱峰对内参比峰的相对保留时间和相对峰面积的比值基本一致(RSD为1．5% ～2．7%)，符合指纹图谱要求。

2．4 HPLC指纹图谱建立

测定了10个不同批次和产地的轮叶党参样品，记录色谱图，确定共有特征色谱峰17个，峰面积之和大于90%，指认了2个色谱峰，分别为齐墩果酸(14号峰)和轮叶党参皂苷(17号峰)。14号峰(齐墩果酸)为有效成分峰，切分离度较好，因此选其为参照峰。以17个特征峰对参照峰的相对保留时间定性指纹图谱中特征峰及10批药材指纹图谱见图1和图2。指纹图谱反映的是样品整体的特征，进行指纹图谱比较，可以反映样品之间的亲疏程度，相似度可以定量地描述指纹图谱，本研究采用夹角余弦和相关系数作为测度，以中位数矢量为共有模式，分别计算样本的相似度。结果见表1。

3 讨论

桔梗和党参同样是桔梗科的药材，与轮叶党参显微特征的主要区别如下。1)石细胞:组织结构上轮叶党参石细胞位于木栓层外侧4～9列，切面排列;党参木栓层外侧有单个或成群的石细胞;桔梗无石细胞。粉末特征中轮叶党参石细胞成群存在，长方形、类方形或类多角形，细胞壁增厚不显著，纹孔稀疏，孔沟不明显;党参石细胞单个散在或数个成群，呈多角形、类斜方形、短梭形或略呈分枝状，纹孔稀疏，孔沟明显。2)导管:轮叶党参粉末主为网纹导管;党参主为具缘纹孔、网纹及网纹具缘纹孔导管;桔梗除了具缘纹孔及网纹导管外，还有梯纹导管。3)木薄壁细胞:轮叶党参粉末木薄壁细胞类方形或长方形，细胞壁显著增厚，3年生以上药材呈连珠状;党参木薄壁细胞不增厚;桔梗木薄壁细胞纵断面观长方形，末端壁细波状弯曲。综上所述，轮叶党参的石细胞群、乳管群、木薄壁细胞显微特征比较典型，石细胞具有与同科属药材相区别的特征。

图1 轮叶党参HPLC指纹图谱

图2 10批轮叶党参药材的叠加指纹图谱及共有模式

本试验先以甲醇为溶剂比较回流和超声两种提取方法，结果两者所得色谱峰的峰数区别不大，回流提取所得主峰的峰面积较大;后又对甲醇、50%甲醇、95%乙醇、50%乙醇等提取溶剂进行试验，发现甲醇提取后所得色谱峰的峰数为最多。因此，本文采用甲醇作为提取溶剂进行回流提取。

考察了207，219，254 nm波长下的指纹图谱，在207 nm处齐墩果酸和轮叶党参皂苷有较强的吸收，检测到的色谱峰数量最多，特征性强，具有良好的代表性，故选择207 nm作为检测波长。

10批药材指纹图谱相似度计算结果在0．84～0．99之间，符合指纹图谱要求，可以作为评价轮叶党参药材质量优劣的方法之一。其中1批相似度低于0．90，说明该批药材质量一般，与外观性状反映的药材质量一致;其余9批相似度均大于0．90，说明药材品质基本一致。

[1]江苏新医学院．中药大辞典[M]．上海:上海科学技术出版社，1977:195．

[2]郭月秋，高 珊，陈代贤，等．山海螺的显微及紫外鉴别[J]．中药材，2003，11(26):786 － 787．

[3]梁志敏，林吉吉，原 忠．轮叶党参化学成分研究[J]．中国中药杂志，32(13):1 363－1 364．

[4]Yuan，Z．，Liang，Z．M．．A new triterpenoid saponin from Codonopsis lanceolata[J]．Chinese Chemical Letters，2006，17(11):1 460 －1 462．