纤维素原料制取燃料酒精的研究概述*

盛晓晓，周如金，唐玉斌

1(江苏科技大学生物与化学工程学院，江苏 镇江，212003)2(广东石油化工学院化工与环境工程学院，广东茂名，525000)

随着世界经济的迅速发展，人口的不断增长和人们生活水平的持续改善，能源消耗的加剧，使得世界能源的短缺和不断增长的需求之间的矛盾日益突出，寻找可再生的替代能源，已经成为维持人类社会和平和可持续发展的紧迫任务。

纤维素是地球上含量丰富的一种可再生资源，经过预处理、糖化、发酵等工艺制取得到的燃料酒精，其生产成本明显低于原油，和以粮食为原料生产的燃料酒精［1］;并且其比热容、辛烷值(抗爆性)、汽化潜热等均优于汽油，又不含硫和灰份等杂质，是一种优质无污染的液体燃料，因此国内外都很重视对燃料酒精的开发和利用。

1 纤维素燃料酒精发展现状

1.1 国外发展现状

20世纪70年代美国、巴西等国家相继启动了燃料酒精计划［2］。美国政府出台的政策很重视并积极鼓励植物纤维原料酒精的生产和使用，在税收和贷款方面给予了优惠和支持。据2002年美国能源部国力能源技术实验室的报道称已经从纤维素燃料酒精中分馏得到航空用的燃料［3］，美国能源部希望在2012年时纤维素酒精的成本能实现1.07美元/加仑的目标，扩大燃料酒精的应用。巴西的燃料酒精工业以甘蔗为主要原料，在世界上可谓年产量最多、工艺也最成熟。近年，以甘蔗渣为原料制取酒精的新技术不仅可以减少水解蔗渣的时间而且能获得较高的转化率，其技术的成熟性和经济的循环性已得到了市场的认可［4］，由巴西选育的酵母菌种也被广泛应用［5］。日本已经建立了较完善的纤维素燃料酒精相关的研发体系，包括项目的综合调整和工艺系统的最优化，生产糖化和发酵相关的酶的菌种选育专题，以及酒精膜脱水技术等研究。另外，德国、加拿大等国家在理论和生产销售方面都已经成功施行，同为发展中大国的印度也已经开展了对燃料酒精的研究和应用［6］。

1.2 国内发展现状

我国燃料酒精产业起步较晚，最初是通过陈化的玉米、小麦等粮食的消化来生产，近年以玉米和木薯［7］为主要原料的燃料酒精产业迅猛增长，2005年我国已成为世界上继巴西、美国之后第三大生物燃料酒精生产国和应用国。考虑到粮食安全问题，政府提倡以非粮资源为原料发展燃料酒精产业，如木薯、甘薯、甜高梁，以及秸秆等农林废弃的纤维素，据统计2007年我国主要作物秸秆产量约为6.56亿t［8］。目前以非粮为原料的燃料酒精试点项目已在多个地方正常运行，同时以农林废弃纤维素为原料的相关研究，也成为了生物能源工程研究领域的热点，如早籼稻、水稻壳、废弃烟叶、甜龙竹蛀粉、香蕉茎叶、小麦秸秆、一年生黑麦草等的研究。

2 燃料酒精的制取工艺

国内外的纤维素燃料酒精的研究发展形势大好，技术工艺也比较成熟，但是在预处理、糖化和发酵的各个环节仍有很多需进一步解决的问题。

2.1 预处理

在燃料酒精制取中起作用的主要是纤维素和半纤维素，纤维素原料成分是木质纤维素，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，由于木质素、半纤维素对纤维素的保护作用以及纤维素本身的结晶结构，天然的木质纤维素直接进行水解时，纤维素转化为糖的效率很低，为了提高水解率，必须采取有效的预处理工艺脱除木质素。

2.1.1 物理法

自然界中的纤维素原料主要是秸秆等，体积大，存贮难，一定程度的机械粉碎是必不可少的，通常有机械粉碎，微波和超声波法，蒸汽爆破法以及高温热水法等。微波和超声波法只能较小程度除去木质素和纤维素的结晶区;蒸汽爆破法能破坏木质素和半纤维素结合层，并造成纤维素晶体和纤维束的爆裂，大大增加纤维素酶的易感性;高温热水能使木质纤维素中的半缩醛键断裂成酸，大幅度提高纤维素的酶消化性，但较难控制分解度，也有一定的污染。物理法对设备要求较高，除了微波和超声波法具有节能的优点外，其他方法都存在能耗大的缺点。

2.1.2 化学法

常用的主要有碱法和酸法两种。碱法最大的优点是能较好的降解木质素，但碱的浓度过高会造成纤维素的损失和较大的污染，Kim等人［9］利用氨水浸泡大麦秸秆做预处理，木质素水解率为66%;浓酸法对纤维素的水解十分有效，但亦存在污染严重的问题;目前国内外常采用稀酸法，半纤维素溶出率高，仅对木质素的去除较弱。另外Mosier等人［10］用双氧水等氧化剂预处理木质纤维素，能脱去50%的木质素和大部分半纤维素，纤维素水解率高达95%，反应过程的一些副产物如糠醛及其衍生物，对后续反应产生了一定抑制作用。

2.1.3 生物法

常用于降解木质素的微生物有白腐菌、褐腐菌、软腐菌等真菌，其中白腐菌是生物预处理法中最常用的一种微生物，主要通过产生一系列的木质素氧化酶来降解木质素;也可用专一的木质素酶处理原料，但成本较高。生物法反应条件温和，对设备要求简单，成本较低，但所需反应周期长，并且在降解木质素的同时也会降解半纤维素和纤维素，例如白腐菌中的典型菌株黄孢原毛平革菌就存在这一缺陷［11］，所以，筛选木质素选择性强且木质素降解能力强的菌株是目前生物预处理法优化的关键。

2.1.4 联合法

实际生产过程中单独采用一种方法往往不能满足要求，常常要联合使用两种或两种以上的方法，才能达到较好的处理效果。El-Zawawy等人［12］以化学制浆法、蒸汽爆破法、微波处理为前处理分别与酸解酶解进行组合试验，处理稻草和玉米芯，结果验证了不同的搭配对葡萄糖转化率和酒精产量有显著的影响。黄玉龙等人［13］，联合了酸碱处理、冷冻、高温高压等的物理化学的方法对小麦秸秆进行预处理，结果表明经稀硫酸在121℃高温蒸煮小麦秸秆60min后，溶液中还原糖含量显著提高，秸秆降解率可达20.6%。

2.2 糖化

纤维素是一种已聚糖，半纤维素主要是戊聚糖，糖化就是指纤维素和半纤维素水解成含几个单糖的低聚糖的过程。

2.2.1 酸水解法

无机酸催化纤维素分解的机理是:酸在水中解离并产生H+，H+与水构成不稳定的水合氢离子。当纤维链上的β-1，4葡萄糖苷键和水合氢离子接触时，后者将一个H+交给β-1，4葡萄糖苷键上的氧，使得这个氧变成不稳定的4价氧，当氧键断裂时，与水反应生成2个羟基，并重新放出H+，溶液中游离H+浓度越高水解速度越快，故多采用强酸，又可分为稀酸水解、浓酸水解。稀酸水解一般要求在高温高压条件下进行，能耗大，时间要求严格，时间过短原料水解不完全，时间过长会使单糖进一步降解成糠醛等化学物质，糠醛等降解物对后续微生物发酵有毒副作用，此时最好选用特定的菌种，如Georgieva等人［14］选用耐热厌氧菌Thermoanaer bacter BG1L1对稀酸水解的方法进行补充改善。浓酸水解反应温度和压力相对温和，对半纤维素，纤维素的水解也十分有效，分步水解时单糖得率可达90%以上，添加某些无机盐为辅助催化剂还可进一步促进酸解作用，但污染大，操作繁琐，还需酸回收系统。

另外，超低酸水解(Extremly low sulfuric acid，ELA)因其设备腐蚀少、环境污染少等优点而成为近年来研究热点。它最初是酶水解的预处理，经改进发现超低酸水解也能带来很高的糖得率。美国可再生能源实验室以超低浓度酸水解工艺在连续逆流反应器、收缩渗滤床(BSFT)和间歇床(BR)进行研究，发现连续逆流反应器在超低酸条件下可得到90%的葡萄糖转化率，BSFT的反应速度是BR的3倍，是一种很有前途的工艺［15］。

总之，酸水解法水解速度快，但是其缺点在于不仅需要耐酸、耐热、耐压的特殊设备，还会使水解所生成糖发生进一步分解或聚合反应，也会产生一些抑制微生物生长的副产物，发酵前还需要一定的脱毒处理否则影响后续酒精发酵，同时也存在污染问题，因此在工业生产中不易实施。

2.2.2 酶水解法

产纤维素酶的微生物有真菌和细菌，典型的木霉纤维素酶是3种酶的混合物，包括葡聚糖内切酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和 β-葡萄糖苷酶(BG)［16］。首先，葡聚糖内切酶作用于微纤维的非结晶区，使其露出许多非还原性末端，随后葡聚糖外切酶从非还原性末端依次分解产生纤维二糖，随后部分降解的纤维素进一步由内切葡聚糖酶和葡聚糖外切酶协同作用，分解生成纤维二糖、三糖等低聚糖，最后由β-葡聚糖苷酶作用分解成葡萄糖。纤维素酶水解的限制步骤是葡聚糖内切酶对无定型纤维素的水解，产生新的非还原末端，进而实现葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的作用。酶水解的最大优点是反应条件温和、能耗低、效率高、选择性强、三废少，缺点是速度慢、周期长。

目前纤维素酶主要依赖真菌中的霉菌生产，活力仍很低，与淀粉酶相比通常要相差2个数量级以上，使纤维素的水解速率和效率都极其低下，生产成本过高，这也是酶法降解纤维素的技术瓶颈。获得纤维素酶高产、高活力菌株，优化酶组分组成，并在此基础上采用固定化酶等进一步提高酶的稳定性和使用寿命，是解决这一问题的根本所在。梁鲜香等人［17］采用导入了β-葡萄糖苷酶基因的pYBGA1酵母进行酒精的发酵使得酵母可以发酵还原性单糖和纤维二糖等混合糖，从而提高了发酵酒精的产率。

2.3 发酵

2.3.1 直接发酵

直接发酵法就是纤维素原料不进行酸解或酶解前处理，直接进行发酵。热纤梭菌是能够直接利用纤维素生成酒精，但分解纤维素能力不如木霉，也有粗糙脉孢菌可以分泌纤维素酶，同时能够将纤维素发酵为酒精。Okamoto等人［18］即在无外加酸和酶的情况下利用白腐菌直接由小麦麸和水稻秸秆发酵得到酒精。单独使用以上某种菌进行发酵时，周期长，产量低，通常可以再接种发酵单孢菌进行混合发酵，有助于提高产量。直接发酵要求的工艺设备简单，成本低廉，但酒精产率不高，易产生有机酸副产物的不足限制了此工艺的发展和应用。

2.3.2 分离发酵

分离发酵(separate hydrolysisand fermentation，SHF)是指水解和发酵分开进行，将纤维素先用纤维素酶糖化，再经酵母发酵，也称水解发酵二段法。这种方法可以分别使用水解和发酵各自的最适条件分别为50℃和30℃，第一阶段，纤维素降解产生的葡萄糖会对纤维素酶产生反馈抑制，而半纤维素水解糖化产生的木糖也会对纤维素酶产生抑制作用，影响纤维素的糖化;第二阶段，酒精发酵的末端产物会抑制与发酵相关的酶的活性，降低酒精得率，必须不断从发酵罐中移出酒精，较高的底物浓度也会对整个发酵过程产生抑制作用。

2.3.3 同步糖化发酵

同步糖化发酵(simultaneous saccharification and fermentation，SSF)是指利用纤维素酶和酵母同时糖化发酵生产酒精。该工艺最大的优点是可消除葡萄糖的反馈抑制，提高纤维素水解速率，同时对设备要求低，整个过程无污染。此法存在木糖的抑制作用、糖化与发酵条件不协调等问题，对于后者目前主要采用耐热酵母进行发酵。Johanssot等人［19］以云杉木为原料同步糖化发酵分馏得到燃料酒精，Park等人［20］从工业河泥中分离得到的耐热酵母KNU5377在50℃SSF系统中发酵得到较高产量的酒精。

3 纤维素燃料酒精技术的发展方向

当前国内外纤维素酒精的商业化存在的主要障碍包括生物催化剂效力不够强大、纤维素酶成本高和综合设备成本高［21］。我国技术工艺不够先进和成熟，较高的成本成为阻碍纤维素燃料酒精的推广的瓶颈，为简化工艺、降低成本，人们进行了大量的研究。其中将纤维素转化过程中的纤维素酶生产、纤维素水解、六碳糖发酵、五碳糖发酵4个中间转化过程在同一反应器中完成的联合生物工艺(consolidated bioprocessing，CBP)［22］引起了人们的关注。联合生物工艺相对于其他一体化程度较低的工艺过程，对技术要求很高，对设备要求低，符合生产成本低，效率高的工业化要求。进一步改善优化生产工艺，成功构建筛选相关的高效菌株，逐步实现联合生物工艺的生产，将会是纤维素燃料酒精走向产业化的大好途径。

3.1 生产工艺的改进

纤维素预处理的方法虽多，但都存在弊端，因此不断改进现有预处理方法以得到更有效并适用于工业化生产的方法是一个重要的研究内容，同时，进一步研究探索多种方法的联合使用以提高处理效果。

纤维素糖化的水解效率和单糖产量，直接影响着发酵过程的酒精产率。酶水解所需的条件在工业利用中体现的优越性，注定其将成为今后研究和应用主要方向。

为减轻发酵过程中酒精对菌株生长及酒精生成的抑制作用，可以采用真空、气提、膜分离等高效技术，将新生成酒精不断分离出去，使发酵罐中的酒精浓度始终≤10%，这样不仅可以提高发酵罐的生产能力、还可以节省后续蒸馏燃料的消耗。此外，采用非等温同时糖化发酵法(NSSF)可以有效解决同步糖化发酵法条件不协调的问题;采用固定化细胞发酵工艺，可以大幅度减少菌种消耗、降低生产成本。

3.2 相关菌株的筛选构建

现今研究者们还需对木质纤维素结构与降解特性关系进一步研究阐明，这能够更好的以基因工程、代谢工程和蛋白工程等现代生物技术为手段，开展纤维素原料制取燃料酒精的整个工艺流程中相关菌株的筛选及构建，这将有益于提高工艺一体化的程度，为联合生物工艺提供优良的菌株。

3.2.1 降解木质素的菌株

在预处理生物法中用来降解木质素的微生物有白腐菌、褐腐菌、软腐菌等真菌，其中白腐菌是最常用的;白腐菌通过产生一系列的木质素氧化酶(MnPs，LiPs和漆酶等)来降解木质素。目前较多的研究认为虫拟蜡菌是这类白腐菌的典型代表，由于缺乏葡聚糖外切酶活力以及对羟基的抑制机制，使其能很好地降解木质素而保留纤维素组分［11］，因此以虫拟蜡菌为改造对象进行的研究值得期待。

3.2.2 产纤维素酶的菌株

纤维素糖化的纤维素酶产生菌有绿色木霉、李氏木霉、根霉、青霉等，其中绿色木霉应用最广，开发具有一定工业和市场潜力的新酶源是当前纤维素酶的主要研究趋势，内容包括菌株选育、菌种发酵培养、产酶活力的检测以及酶的分离纯化。有研究已得到的能大量生产高活力纤维素降解酶系的发酵用菌，仍可以对其基因进行修饰和改造，有望进一步提高酶的产量和活力，同时改进酶的回收利用技术也有利于降低酶的成本。另外依赖蛋白质工程改造天然纤维素酶的结构，去促进酶活性中心的作用位点与纤维素的结合，能够提高酶作用的敏感性，有利于糖化。

3.2.3 发酵菌株

纤维素和半纤维素糖化后最终是六碳糖(以葡萄糖为主)的发酵为主，五碳糖(以木糖为主)的发酵相对困难，目前菌种研究主要集中于酿酒酵母［23－24］、运动发酵单胞菌［25］、大肠杆菌和克雷白氏杆菌等，均不能直接发酵五碳糖，所以研究者们一直致力于通过基因工程的手段来解决发酵菌株对五碳糖的发酵问题，大肠杆菌和克雷白氏杆菌具有较宽的底物利用范围引起了研究者的关注。国内外的研究者已经对纤维素发酵的菌种进行了大量的研究工作，也得到了具有一定效率的重组菌株。但这些工作基本上是基于单个基因或是某个代谢途径的几个基因的改造，部分改变了细胞的代谢平衡，得到新的表型，这种有限的改变并没能够解决木糖代谢途径中的复杂问题，使得构建得到的重组菌株还未能在商业化中得到推广应用，即使如此这些成果也为后续研究奠定了基础。

4 展望

我国是一个发展中的农业大国，人口众多、化石资源有限，从农村经济的发展、生态环境的改善、新能源的开发等多方面考虑，以纤维素原料制取燃料酒精的研究和发展有着重要的意义。我们相信，依靠政府的大力支持和科研工作者的努力钻研，我国工业化生产纤维素酒精方面将会取得长足的发展和进步。

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