单宁酶制备研究进展

王 挥 黄寿恩，2 颜 红 黎继烈 李忠海

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.长沙理工大学，湖南 长沙 410015；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

单宁酶制备研究进展

王 挥1黄寿恩1，2颜 红3黎继烈1李忠海1

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.长沙理工大学，湖南 长沙 410015；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

单宁酶主要由曲霉属等微生物发酵制备。它能够水解单宁中的酯键和缩酚羧键，生成重要的工业原料没食子酸等化合物。单宁酶已广泛应用于食品饮料、化妆品工业和饲料工业等领域。文章着重综述国内外在单宁酶菌种选育、培养基发酵体系、发酵生产、提取与分离纯化、固定化技术等制备方法方面研究的新进展，分析单宁酶制备研究的发展趋势。

单宁酶；菌种选育；发酵培养基；固定化酶

单宁酶又称鞣酸酶，全称为单宁酯酰水解酶（tannase，EC 3.1.1.20），是由微生物在单宁酸存在的条件下诱导合成的一种细胞膜结合酶。单宁酶可作为脱除单宁成分的添加剂广泛应用于茶、葡萄酒、啤酒及果汁饮料的生产中，如用于茶饮料沉淀抑制剂、啤酒澄清剂、蛋白纯化单宁酸去除剂等；单宁酶还可用于制备没食子酸丙脂抗氧化剂、儿茶素单体和皮革鞣制剂等工业生产领域。目前，酶制剂工业发达的国家，如美国、日本等已开发出单宁酶在皮革、化妆品、食品饮料、精细化工、饲料工业等方面的多种用途［1］。随着单宁酶应用日趋广泛，市场需求量不断加大，国内外学者对单宁酶的制备进行了深入的研究。

1 产单宁酶菌种的选育

产单宁酶的菌种广泛存在于自然界植物与微生物中，但从自然环境中筛选出菌种的单宁酶酶活力往往不高，利用现代科学技术，尤其是生物技术选育高产、高活力的单宁酶菌株是当今研究的热点。

郭鲁宏等［2］利用富集培养技术，从天然源分离得到一株具有较高单宁酶活性的黑曲霉菌株。后来，该作者［3］用紫外线诱变处理黑曲霉No.13菌株，获得一株制备原生质体的起始菌，对该诱变株进行方案优化和筛选，最后得到一株具有稳定遗传性的单宁酶菌株。龚加顺［4］以黑曲霉9401为出发菌株，经3次N＋离子注入诱变，选育出一株单宁酶高产菌株9701，应用于红茶"冷后浑"的转溶。结果表明，经诱变选育的菌株比出发菌的酶活提高了2.89倍。周纪东［5］以产单宁酶黑曲霉菌株为出发菌，采用微波诱变与化学诱变相结合的复合选育获得高产单宁酶的黑曲霉L21菌株，在最优发酵条件下，该菌株单宁酶酶活力可达225.8U／mL。宋志萍等［6］从香蕉茎叶、茶叶及香蕉土壤、茶土壤环境中经初筛和复筛分离纯化出16株产单宁酶的菌株，并筛选出3株高酶活值的菌株。Rintu B等［7］采用混合培养技术从富含单宁酸的基质生产单宁酶和没食子酸，即将丝状真菌米根酶和恶臭曲霉两种酶进行混合培养，产生的单宁酶酶活力和转化率明显优于单独培养的酶活力。Jogeswar S P［8］用紫外线照射、加热和3－硝基5－甲胍处理米根霉和恶臭曲霉混合培养生产的孢子粉使之诱变，从菌落中分离筛选得到的最优突变株，经发酵培养后所产单宁酶和没食子酸的生物转化率分别达到53.6U／mL和95.2%。Murugan K 等［9］从制革厂、栲胶厂等排放的污水中筛选和分离单宁酶真菌，获得可产单宁酶的菌株。栾丽杰等［10］以涩柿为培养基质，通过初筛和复筛，筛选出的最佳菌株经鉴定为产生涩柿单宁酶的黑曲霉纯种菌株，菌株培养和测试表明，该菌株COD去除率高，单宁耐受力强，具有开发成为工程菌株的潜力。谷文等［11］从铁冬青等4种植物的新鲜茎、叶组织中分离得到52株真菌，经平板透明圈法初筛得到16株产单宁酶菌株。在最佳发酵条件下，选育的1株木霉属真菌 No.MY－P－07酶活力达到0.392μmol／（min·mL）。

上述研究表明单宁酶菌种选育的关键是从自然环境中筛选出高产菌株。而两种或两种以上菌种混合培养往往比单独培养所产单宁酶的活力高，菌种的混合培养是可提高单宁酶的产量。

2 产单宁酶培养基

2.1 培养基底物及其工艺优化

在产单宁酶的培养基发酵体系中，单宁酸或含有没食子酸的基质为必需组分。在发酵法制备单宁酶的研究中，往往采用直接添加纯单宁酸或选择富含单宁酸的物质作为培养基底物。某些富含单宁酸的天然植物用于发酵产单宁酶的基质底物，甚至优于用纯单宁酸作底物。如Pradeep K等［12］分别选用8种含单宁酸的植物树皮提取液作底物，液体深层发酵制备单宁酶，其酶活比用纯单宁酸发酵所产单宁酶高两倍。Mukherjee G等［13］分别用包含45%，58%单宁酸的诃子（terminalia chebula）和肉荚云实（caesalpinia digyna）的果实粉末，进行由黑曲霉固体发酵产单宁酶的研究获得成功，利用废弃物生产单宁酶可以变废为宝，经济环保。Sabu A等［14］研究比较了罗望子籽粉、棕榈仁饼、麦麸和咖啡壳固态发酵产单宁酶，结果发现咖啡壳所产胞外单宁酶最多。据B Trevino－Cueto等［15］报导，生长在美国西南、墨西哥北部沙漠中的一种名为Larrea tridentate Cov.富含单宁酸的植物，可作为真菌固态发酵积累没食子酸和单宁酶的便宜底物。

近年来，诸多学者以提高底物转化率和酶活力为目标，对产单宁酶发酵培养的优化进行了探讨。林健辉等［16］以曲霉T3－5－1为培养菌株，测得该曲霉在优化培养基配比及培养条件下产单宁酶的活力比优化前提高近4倍。马如意等［17］采用响应面法试验设计，对一株黑曲霉固体发酵产单宁酶的培养基进行优化，选定玉米浆、五倍子和MgSO4为培养基影响因子，建立的模型优化预测值经验实验证明，菌株产单宁酶酶活力与优化前相比提高了1.82倍。由此可见，培养基配比及其优化是提高产单宁酶活力和底物转化率的重要途径。

2.2 培养基体系中的碳、氮源

碳源和氮源是微生物生长的必需物质，微生物种类不同或微生物积累的代谢产物不同，对碳源和氮源的需求都有差异。刘如石等［18］研究用不同碳、氮源的种类和比例等因素对黑曲霉产单宁酶的影响，结果表明，豆粕＋NH4NO3与K2HPO4等碳、氮源的交互作用极显著，而豆粕＋NH4NO3、单宁、小麦粉对产单宁酶作用明显。周纪东［5］通过试验比较了蔗糖，葡萄糖，糊精，可溶性淀粉，小麦粉，羧甲基纤维素等碳源、NaNO3、NH4Cl、尿素、玉米粉、酵母浸膏等氮源，对黑曲霉LZI菌株产单宁酸的影响。Bratali K等［19］研究认为大豆提取液在0.05%～1.0% （m／V）时，对单宁酶的活力有抑制作用，而当培养液中硫酸铵铁、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵浓度为0.1% （m／V），尿素浓度为1.5mol时，单宁酶活力得到提高。游见明［20］用黑曲霉QG0301发酵制备单宁酶，正交试验优化碳、氮源配比和其它条件，单宁酶产量均值达到18.55U／mL。曾维丽等［21］分别考察了葡萄糖，乳糖，淀粉、蔗糖等碳源和 NaNO3、尿素、NH4Cl、（NH4）2SO4等氮源，对黑曲霉产塔拉单宁水解酶的影响，在相应适宜条件下，产塔拉单宁水解酶的酶活力达44.29U／mL。Banerjee D等［22］、Enemuor S C等［23］先后报道了用出芽短梗霉、溜曲霉发酵产单宁酶，对碳、氮源及其它培养条件进行优化，以提高单宁酶产量。这些研究说明，在培养基体系中，单宁与非单宁碳、氮源的种类和比例对产单宁酶活力均有重要影响。

3 发酵法制备单宁酶

3.1 液体发酵法

液体发酵法是指以液体培养基作原料进行微生物的培养和产酶的方法。

Iibuchi S等［24］是较早报道发酵法制备单宁酶的研究者之一。他们用单宁酸作诱导米曲霉菌株，并优化了产单宁酶的最适培养条件。Brsadoo S等［25］对日本黑曲霉产单宁酶进行液态发酵，所产单宁酶酶活由29.13U／mL 提高到33.06U／mL。汤茜［26］从多株霉菌中筛选出单宁酸降解能力较强的无花果曲霉，并进行了真菌单宁酸液态发酵降解率的测定和无花果曲霉液态发酵产单宁酶的最适发酵条件的探讨。栾丽杰［27］从涩柿作为微生物生长的微环境中获得黑曲霉纯种菌株，液态发酵产单宁酶，将经优化的培养基置于160r／min摇床中恒温培养（28℃）72h，获得了较大生物量和最高产酶能力。谢晓莉等［28］对黑曲霉B0201液体发酵产单宁酶的研究表明，该菌株液体发酵所产胞内酶的酶活可达到145.2U／mL。液体发酵产生的单宁酶不易污染杂菌，条件易于控制，可随时检测酶活力，但液体发酵生产单宁酶往往酶活较低，且该法所产单宁酶主要为胞内酶，细胞破壁工艺繁琐，难以实现规模化生产。

3.2 固体发酵法

固体发酵法是指在固体、半固体或富含营养物质的惰性载体上进行微生物培养和产酶的方法。该方法与液体发酵法相比在胞外产酶、pH和热稳定性等方面具有优越性，酶活和底物的生物转化率较高，且设备简单，易于推广应用。

谢晓莉等［29］研究黑曲霉产单宁酶采用半固体发酵法，最优条件下单宁酶的活力最高可达144.39U／mL，但所产酶主要为胞内酶。Chatterjee R等［30］以麸皮和单宁组成培养基，在40℃、72%湿度、pH 5.0条件下培养4d，用稻根菌固体发酵制备得到单宁酶。Lekha P K 等［31］对黑曲霉DKL104产单宁酶进行了不同发酵方法的研究，结果显示，液体发酵黑曲霉所产单宁酶主要是胞内酶，而固体发酵所产的单宁酶绝大部分为胞外酶；消耗等量的培养基，固体发酵的培养时间仅为液体表层发酵、液体深层发酵的1／2，而单宁酶酶产量分别为二者的1.8倍和2.5倍。Cristóbal N A等［32］研究发现，与液体深层发酵相比较，用固体发酵黑曲霉Aa－20的单宁酶产量提高两倍以上，且固体发酵对高单宁酸浓度的耐受力增强，所产单宁酶的杂蛋白酶较少，酶活力更高。邱树毅等［33］发明了一种用五倍子生料经固体发酵生产单宁酶的方法，采用生料直接接种黑曲霉固体发酵生产单宁酶。避免了高温对原料的破坏，设备和生产流程简单，生产效率高。

工业上固体发酵采用的分批发酵模式，存在着发酵接种量大、不能重复利用、生产效率低（易污染杂菌）的缺点，Van de Lagemaat J等［34］研究用含单宁酸的模拟底物制备光孢青霉单宁酶，尝试以不用补料接种，连续供给固体基质的方法进行固体发酵。这种进行连续固体发酵克服了上述分批固体发酵的不足。但连续固体发酵的生长动力学的关系、接种机制及工艺条件控制等尚需进一步研究。

4 单宁酶的提取与分离纯化

单宁酶是一种细胞膜结合酶，既存在于细胞内，又存在于细胞外，对于菌丝体中的单宁酶要先进行细胞破壁。在单宁酶的分离纯化过程中，破壁取酶是主要的难题。如曲霉属的单宁酶为胞内酶，分布在真菌的细胞壁与细胞膜之间，结合得非常牢固，相当于固定在细胞中。只有将细胞破壁，使酶尽可能地释放出来，才能高效提取单宁酶。近年来，国内外学者以提高产单宁酶活力为目标，探索了多种细胞破壁方法。Barthomeuf C.等［35］利用冻融法破壁，提高了所得单宁酶活力，在后续研究中，把产单宁酶的菌种与产几丁质酶的链霉菌菌丝体进行保温共培养，即酶法破壁的方法提取单宁酶，结果发现单宁酶胞内酶的释放量达到53%。Gupta R.等［36］报导了在产单宁酶发酵液的等电点，加入单宁和PEG－6000沉淀单宁酶蛋白，可快速提取胞外单宁酶。

单宁酶的纯化通常采用层析法，如离子交换柱、疏水层析、分子筛层析等方法。Beverini M 等［37］研究了从米曲霉（Asp oryzae）No.7发酵液中分离纯化单宁酶：加入硫酸铵达到0.8饱和度，放置15h后，用加有助滤剂硅藻土535的漏斗过滤，再将沉淀溶于水中，离心后得到粗单宁酶液，进一步用DEAE－Sephadex A50离子交换和Sephadex G－100凝胶过滤，获得了纯化的单宁酶；Hossam S等［38］先将发酵液过滤和离心，用硫酸铵（65%）沉淀单宁酶，再离心溶解后分别通过Sephadex G－25层析柱、DEAE－纤维素阴离子交换层析柱和Sephadex G－150层析柱，得到电泳纯级的单宁酶；倪田表等［39］采用两步法快速分离纯化黑曲霉产单宁酶，其纯度经检验亦达到电泳纯。王维维等［40］将黑曲霉发酵生产胞外单宁酶，经硫酸铵分级沉淀、DEAE－纤维素层析、葡聚糖G－150凝胶柱层析纯化，获得的单宁酶纯化倍数高达18.44。

20世纪80年代兴起了一种蛋白质提纯新技术：反向胶束系统［41，42］，其基本原理［43］是在有机溶剂中，当表面活性剂的疏水性基团向外与有机溶剂接触，亲水性基团向内排列形成极性区域时，形成一个个胶团，胶团内部能为酶提供最佳微环境。酶分子可容纳于胶团之中而与其他杂质相分离。与其它提纯方法相比，反向胶束系统可以有效地提高单宁酶的回收量，纯化时间大为缩短，更适合于工业化生产。

5 单宁酶的固定化

酶作为生物催化剂，其优点是：具有较高的（甚至是专一的）选择性、良好的催化效率、温和的反应条件等。缺点是：在强酸、强碱、高温、高离子浓度和部分有机溶剂等条件下，游离状态的酶不稳定，酶蛋白易变性，酶的催化活性降低甚至丧失，同时，游离酶不易从底物和产物中分离出来，反应产物纯化工艺较为复杂，可溶性酶往往只能一次性地起催化作用，难以重复使用，从而限制了酶促反应的应用。

固定化酶技术可以克服游离酶的不足，提高酶的操作稳定性，酶可以回收及重复使用，可实现连续自动化生产。吸附法、包埋法、交联法和共价偶联法等是酶固定化的主要方法［44］。Weetall H.H.等［45］采用一种具有一定孔径的多孔玻璃珠固定单宁酶，与未经固定化的游离酶比较，固定化单宁酶的pH稳定范围向碱性漂移，热稳定性范围更宽。程琦等［46］采用自制的壳聚糖固定单宁酶，测得以没食子酸丙酯作底物时固定化单宁酶的最适pH值为6.4，比游离单宁酶最适pH值（5.8）向碱性区域偏移了个pH 0.6位，而固定化单宁酶的稳定pH值范围比游离单宁酶有所变窄。Boadi D K等［47］比较了多种载体对单宁酶固定化的影响，结果表明，以壳聚糖包裹海藻酸钙，用戊二醛交联所生产的胶珠性能最佳。刘冠卉等［48］以壳聚糖为原料，筛选出壳聚糖海绵载体固定化单宁酶，与游离酶相比，固定化酶的最适反应pH向酸性偏移，最适反应温度有所提高，对金属离子和EDTA的稳定性增强，半衰期也明显延长。范超等［49］在玉米芯固定化单宁酶的研究中，采用Box－Behnkens试验设计和响应面分析方法，优化了改性玉米芯固定化单宁酶的工艺条件：单宁酶酶液与玉米芯载体比26∶1（V∶m）、pH 6.8、时间8.0h、温度36℃。固定化单宁酶酶活力达到（16 085±5）U／g。王挥等［50］以 LX－1000HA 树脂为载体固定化单宁酶，在最佳工艺条件下制备的固定化单宁酶，其酶活力，对温度和pH的适应性和稳定性，均优于游离酶。LX－1000HA树脂是一种价格较低廉的国产树脂，用于单宁酶固定化研究和制备具有良好的市场前景。

6 结束语

有关单宁酶的基础理论与实际应用的研究，美国、日本等开展较早，并已取得重要成果，一些公司已能进行单宁酶的批量生产，而中国国内单宁酶的生产尚未形成规模化生产经营，单宁酶的生产效率偏低，价格昂贵。中国生产单宁酶的自然资源十分丰富（中国产单宁酶的五倍子产量约占世界总产量的95%），又是工业上应用单宁酶的消费大国（中国是茶叶生产、消费和出口大国之一，茶叶产量占世界的1／3，进行深加工需要大量的单宁酶）。随着对单宁酶需求量的日益增长和研究的不断深入，发现和选育新的高产单宁酶菌株、有利于提高单宁酶活力的诱导底物与优化培养基组成；改进和创新适合于工业化生产的单宁酶的发酵工艺，特别是固体发酵工艺、分离纯化技术及生产设备，提高产酶效率，降低生产成本；进一步开展固定化酶技术（包括固定化细胞技术）研究，开发实用、廉价和高效的固定化酶载体，提高单宁酶重复使用率和实现连续自动化生产，将是单宁酶制备研究的发展趋势。

1 P K Das Mohapatra，C Maity，R S Rao，et al.Tannase production by bacillus licheni form is KBR6：optimization of submerged culture conditions by Taguchi DOE methodology［J］.Food Research International，2009，42（4）：430～435.

2 郭鲁宏，杨顺楷.黑曲霉单宁酶高活性菌株的诱变选育［J］.微生物学通报，2000，27（2）：105～108.

3 郭鲁宏，杨顺楷.单宁酶产生菌的筛选和发酵条件研究［J］.应用于环境生物学报，1998，4（4）：386～389.

4 龚加顺.单宁酶的固定化及其在红茶饮料澄清化中的应用研究［D］.重庆：西南农业大学，1998.

5 周纪东.黑曲霉产单宁酶的研究和有机相中固定化黑曲霉细胞生物合成没食子酸丙酯的初探［D］.杭州：浙江大学，2002.

6 宋志萍，蔡俊鹏，曹丽芳.香蕉及茶叶中单宁降解菌株的筛选［J］.现代食品科技，2005，21（3）：39～41.

7 Rintu B，Gargi M.Microbial transformation of tannin－rich substrate to gallic acid through co－culture method［J］.Bioresource Technology，2005，96（8）：949～953.

8 Jogeswar S P.Strain improvement for tannase production from co－culture of Aspergillus foetidus and Rhizopus oryzae［J］.Bioresource Technology，2006，97（6）：795～801.

9 Murugan K，Saravanababu S，Arunachalam M.Screening of tannin acyl hydrolase（E.C.3.1.1.20）producing tannery effluent fungal isolates using simple agar plate and SmF proces［J］.Bioresource Technol，2007，98（4）：946～949.

10 栾丽杰，杨永涛.产涩柿单宁酶菌株的筛选及鉴定［J］.安徽农业科学，2010，38（20）：10 499～10 501.

11 谷文，杨亦陈，王石发.产单宁酶真菌的筛选及产酶条件［J］.南京林业大学学报（自然科学版），2010，34（3）：6～10.

12 Pradeep K，Das M.Production of tannase through submerged fermentation of tannin－containing plant extracts by bacillus licheniformis KBR6［J］.Polish Journal of Microbiology，2006，55（4）：1 733～1 331.

13 Mukherjee G，Banerjee R.Biosynthesis of tannase and gallic acid from tannin rich substrates by Rhizopus oryzae and Aspergillus foetidus［J］.Journal of Basic Microbiology，2004，44（1）：231～233.

14 Sabu A，Angur C，Swati C，et al.Tannase production by Lactobacillus sp. ASR－S1under Solid－state fermentation［J］.Process Biochemistry，2006，41（3）：575～580.

15 B Trevino－Cueto，M Luis，J C Contreras－Esquivel，et al.Gallic acid and tannase accumulation during fungal solid state culture of atannin－rich desert plant（Lanrrae tridentate Cov.）［J］.Bioresource Technology，2007，98（26）：721～724.

16 林健辉，黄曼曼，陈雪香，等.曲霉T3－5－1产单宁酶培养条件优化［J］.食品科学，2010，31（19）：245～249.

17 马如意，赵祥颖，刘建军.单宁酶产生菌的发酵培养基优化［J］.中国酿造，2011（6）：153～155.

18 刘如石，李清明，谢达平，等.Asp.niger No.3液态发酵生产单宁酶条件的研究［J］.食品科学，2001，22（2）：28～32.

19 Bratali K，Rantu B.Effect of additives on the behavioural properties of tannin acyl hydrolase［J］.Process Biochemistry，2003，38（9）：1 285～1 293.

20 游见明.黑曲霉单宁酶发酵工艺［J］.现代食品科技，2005，21（3）：96～101.

21 曾维丽，姚开，贾冬英，等.塔拉单宁水解酶产生条件的研究［J］.天然产物研究与开发，2006，18（4）：592～595.

22 Banerjee D，Pati B R.Optimization of tannase production by Aureobasidium pullulans DBS66［J］.J.Microbiol Biotech，2007，17（6）：1 049～1 053.

23 Enemuor S C，Odibo F J C.Culture conditions for the production of a tannase of Aspergillus tamarii IMI388810（B）［J］.Afr.J.Biotech，2009，8（11）：2 554～2 557.

24 Iibuchi S，MinodaY，Yamada K.Studies on tannin acly hydrolase of m icroo rganism sⅡ.A new method of determing the enzyme act ivity using the change of uitra violet absorption［J］.Agri.Bio.Chem.，1967，31（5）：513～518

25 Bradoo S Gupta，P K Saxena.Parametric optimization and biochemical regulation of extracelluar tannase from Aspegillus japonicus［J］.Process Biochemistry，1997，32（2）：135～139.

26 汤茜.真菌单宁酶的研究［D］.中山：中山大学，1999.

27 栾丽杰.分泌涩柿单宁酶的微生物筛选及其酶特性的研究［D］.西安：陕西师范大学，2007.

28 谢晓莉，刘明，邱树毅，等.黑曲霉B0201液体发酵产单宁酶最佳工艺条件研究［J］.中国酿造，2010（8）：30～33.

29 谢晓莉，邱树毅，刘明，等.黑曲霉半固体发酵产单宁酶的工艺优化［J］.贵州农业科学，2010（11）：153～155.

30 Chatterjee R，Dutta A，Banerjee R，et al.Production of tannase by solid－state fermentation［J］.Bioprocess Engineering，1996，14（3）：159～162.

31 Lekha P K，Lonsane B K.Comparative titres，location and properties of tannin acyl drolaseproduced by Aspergillus niger PLK 104in solid－state，liquid surfase and submerged fermentations［J］.Process Biochemistry，1994，29（6）：497～503.

32 Cristóbal N A，Christopher A.Induction and repression patterns of fungal tannase in solid－state and submerged cultures［J］.Process Biochemistry，2001，36（6）：565～570.

33 邱树毅，王广莉，保玉心，等.一种用五倍子生料固体发酵生产单宁酶的方法：中国，200810301169［P］.2008－09－10.

34 Van de Lagemaat J，DL Pyle.Solid－state fermentation and bioremediation：development of a continious process for the production of fungal tannase［J］.Chmical Engineering Joural，2001，84（2）：115～123.

35 Barthomeuf C，Regerat F，Pourrat H.Production，purification and Characterization of a tannase from Aspergillus niger LCF8［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1994，77（3）：320～323.

36 Gupta R，Bradoo S，Saxena R K.Rapid purification of extracellular tannase using polyethylene glycol－tannic acid complex［J］.Letters in Applied Microbiology，1997，24（4）：253～255.

37 Beverini M，Metche M.Identification，purifieation and physicovhemical properties of tannase of aspergillus oryzae［J］.Sciences des Aliments，1990，10（4）：807～816.

38 Hossam S，Hamdy.Purification and characterization of a newly isolated stable longlife tannase produced by F.subglutinans［J］.J.Pharm.Innov.，2008（3）：142～151.

39 倪田表，王菊芳.两步法快速分离纯化单宁酶的研究［J］.中国酿造，2010（5）：109～113.

40 王维维，邱树毅，谢晓莉，等.胞外单宁酶纯化及酶学性质的研究［J］.食品科学，2011，32（13）：239～243.

41 Kadam K L.Reverse micelles as a bioseparation tool［J］.Microb.Technol.，1986，8（5）：266～273.

42 Giovenco S，Verheggen F.Purification of intracellular enzymes from whole bacterial cells using reversed micelles［J］.Enzyme Microb.Technol，1987，9（8）：470～473.

43 田桂玲，邢国文，叶蕴华.在非水介质中进行酶促反应的几个重要问题［J］.有机化学，1998，18（1）：11～19.

44 陈石根，周润琦.酶学［M］.上海：复旦大学出版社，2001.

45 Weetall H H，Detar C C.Immobilized tannase［J］.Biotechnology and Bioengineering，1974，16（8）：1 095～1 102.

46 程琦，程启坤，李名君.单宁酶的固定化及其在酯型儿茶素水解反应中的应用［J］.生物化学杂志，1996，12（4）：423～426.

47 Boadi D K，Neufeld R J.Encapsulation of tannase for the hydrolysis of tea tannins［J］.Enzyme and Microbial Technology，2001，28（7～8）：590～595.

48 刘冠卉，屠洁，马海乐，等.壳聚糖固定化单宁酶及其澄清绿茶汤的应用研究［J］.食品与发酵工业，2008，34（10）：16～169.

49 范超，黎继烈，王挥.玉米芯固定化单宁酶的工艺条件优化［J］.食品科学，2011，32（11）：123～128.

50 王挥，袁强，范超，等.LX－1000HA树脂固定化单宁酶的工艺优化［J］.食品与机械，2011，27（5）：168～171.

Advances on preparation of tannase

WANG Hui1HUANG Shou－en1，2YAN Hong3LI Ji－lie1LI Zhong－hai1

（1.Central South University of Forestry ＆Technology，Changsha，Hunan41004，China；2.Chansha University of Science ＆Technology，Changsha，Hunan41015，China；3.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan410208，China）

Tannase is mainly prepared by Aspergillus and other microbial fermentation.The ester bonds and depside bonds in Tannin can be thydrolysis by tannase and combinat important industrial material gallic acidsand other compounds.Tannase has been widely applied in such areas as food and beverages，cosmetics and feed industries.The article reviews on the new developments about tannase－producing strains breeding，medium for fermentation system，fermentation production extraction and purification，immobilized enzyme technology of tannase，et al.and the development trend of researches on tannase preparation.

tannase；strain breeding；fermentation medium；immobilized enzyme

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.067

国家“948”项目（编号：2012－4－17）

王挥（1974－），男，中南林业科技大学助理研究员，博士。Email：wh9469＠126.com

2012－01－30