口蹄疫诊断及疫苗等研究综述

陈国花 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）



口蹄疫诊断及疫苗等研究综述

陈国花 （山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

1 FMDV的分类地位及形态特征

口蹄疫病毒(FMDV)属于微核糖核酸病毒科中的口蹄疫病毒属。FMDV是已知较小的动物RNA病毒，病毒粒子直径23~25nm，呈圆形或六角形，由60个结构单位构成20面体。所含核酸为RNA，全长8.5kb。在负染标本中，可见衣壳由32个壳粒组成，口蹄疫病毒的壳粒大于其它小RNA病毒的壳粒。取感染细胞培养物作超薄切片，进行电子显微镜检查，常可见到胞浆内的口蹄疫病毒呈晶格状排列。X线衍射分析证明，口蹄疫病毒除VP1蛋白第141~160位氨基酸突出于表面外，整个病毒粒子呈光滑平整的球形，不具有其它小RNA病毒表面的凹陷结构。

2 FMDV的遗传变异

FMDV的毒力和抗原性均易发生变异，经过不断的抗原“漂移”过程，导致一系列亚型的产生。FMDV基因组中编码衣壳蛋白的核苷酸发生变异从而导致病毒抗原性的变异。分析口蹄疫病毒结构蛋白的差异，可以发现VP1的变异性最高，特别是其编码病毒抗原的核苷酸序列是一个可变区，是由抗原表位的氨基酸缺失、添加或替换造成的。VP4几乎不发生变异[1]。四种衣壳蛋白的变异顺序VP1〉VP3〉VP2〉VP4。欧洲O、A、C三个型中任何两个型的氨基酸同源性约为60%。曾有人对3个O1亚型的核苷酸序列进行比较，发现编码VP1的核苷酸高度同源，达98%；在O1亚型VP1多肽的213个氨基酸中，三个毒株之间只有3个氨基酸残基不同。但在几个C3亚型毒株之间，核苷酸序列中有25个碱基序列不同，结果造成8~9个氨基酸残基的变化。随后又证实，各型病毒之间不仅组成抗原环的氨基酸种类不同，而且组成这种抗原环的氨基酸数目也有差异：以SAT3最多，为VP1 124~165号氨基酸；其次是O、A、C型，分别比SAT3少5、7、9个氨基酸。

3 口蹄疫诊断技术研究

FMD是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，世界大部分地区时有发生，常在牛群及猪群大范围流行。此病的致死率很低，但是感染率很高。口蹄疫的大规模流行，会给农牧业生产造成极大的危害，并波及到市场上毛、皮、肉、奶的供应以及以毛、皮、肉、奶为原料的食品加工业和轻工业，给畜牧业和进出口贸易造成巨大的经济损失，直接威胁着国家声誉和人类食品卫生安全，因而受到国内外的普遍关注。口蹄疫病毒共有7个血清型：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1型，每个型又可以进一步分为亚型。由于不断发生抗原漂移，因此并不能严格区分亚型。口蹄疫诊断只能在指定的实验室进行。送检样品包括水泡液、剥落的水泡、抗凝血或血清等。死亡动物可采集淋巴结、扁桃体及心脏。样品应冰冻保存，或置pH7.6的甘油缓冲液中。目前口蹄疫的检测技术主要有病毒分离技术、血清学检测技术和分子生物学技术等。

3.1 病毒分离技术

病毒分离技术是检测口蹄疫的黄金标准，主要有细胞培养和动物接种2种方法。

3.1.1 细胞培养 检测口蹄疫最初用的细胞是单层初代猪肾细胞，后来随着细胞培养系统的不断增多，有许多培养细胞都可用于FMDV的分离。其中初代小牛甲状腺(CYT)细胞分离FMDV时特别敏感[2]，此外还有小牛肾细胞[3]、仓鼠肾细胞系BHK21等。目前许多实验室都将CYT细胞和IBRS 2培养细胞(猪肾细胞系)作为分离FMDV的常规细胞，这2种细胞系可将FMDV和SVDV(猪水泡病病毒)区分开，因为FMDV可在这2种细胞上生长，且有相似的细胞病变，而SVDV只能在IBRS 2细胞上生长。

3.1.2 动物接种 动物接种常用乳鼠进行，通常情况下进行病毒分离需要用8~10只小鼠，以便于观察接种鼠的死亡情况和获得足够多的抗原，并在进行补体结合试验(CFT)时获得明显的阳性结果。当致病性毒株非常重要时，也可用牛等动物来分离病毒。

3.2 血清学检测技术

血清学诊断技术主要有病毒中和试验(VNT)、CFT、间接血凝试验、乳胶凝集试验、免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光抗体试验、免疫荧光电子显微镜技术等。

3.2.1 补体结合试验 CFT是较早的应用于诊断FMD的血清学诊断技术之一，最初的CFT是在试管中进行的，后来被微量法所替代，微量法操作简便，节省试剂，但是CFT的敏感性不高，且易受样品中的亲补体性和抗补体物质的干扰。

3.2.2 病毒中和试验 病毒中和试验是OIE推荐的检测FMDV抗体的标准方法。在进行抗原鉴定时病毒中和试验比补体结合试验要好，但体外VNT试验也有一些缺点，如需用的细胞生长不一致、病毒敏感性的变化、外源性微生物因子(如细菌和真菌)的可能性干扰以及被试血清对细胞的不同影响等等，这一方法必须使用活病毒，非普通实验室所能操作，而且中和试验全然不能区分免疫抗体和感染抗体。

3.2.3 酶联免疫吸附试验 ELISA试验检测口蹄疫具有特异、敏感、快速、简便、可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速的检测大量样品，在FMD的诊断中日益受到人们的重视，现已成为国际上检测FMD的常规方法之一。

3.3 分子生物学技术

近年来，随着分子生物学的飞速发展，以及对FMDV研究的不断深入，已经建立起检测FMDV的各种分子生物学方法，其中包括聚合酶链式反应(PCR)、核酸探针、核酸序列分析、电聚焦寡核苷酸指纹图谱法、基因芯片技术等等。

3.3.1 聚合酶链式反应(PCR) PCR诊断技术在使用时以特殊设计的引物作介导及在反转录酶的作用下再进行PCR扩增，扩增产物用PAGE或琼脂糖电泳或硝酸银染色检查，看扩增出的DNA片段大小与设计是否相符。PCR检测法与其它方法相比其特点是特异性好，灵敏度高，简便快速，对检测样品要求低。在分子流行病学中RT-PCR可与序列分析结合研究不同分离株之间的系统关系，也有助于追踪该病暴发的传染源。

3.3.2 核酸探针 即用放射性同位素标记核酸的cDNA拷贝，可以特异地同待检样品中的病毒核酸结合，这种结合可以通过放射自显影显现出来，这一方法是当前最敏感的方法。其缺点是试验程序较为繁琐，而且同位素标记半衰期短，并污染环境。相关学者用32P标记克隆在质粒上的FMDV基因组聚合酶序列作为探针，对实验感染牛的食道/咽部刮取物进行了检测，认为此法为进出口动物FMD检测提供了快速、准确的检测方法[4]。

4 口蹄疫疫苗的研制

使用灭活疫苗，需经常重复免疫接种，才能维持保护，弱毒疫苗存在的散毒和毒力返祖现象、灭活疫苗中的活毒残留问题及因毒株的抗原漂移和基因组的变异选择而导致疫苗接种失败等现象都可能造成FMD的大流行。同时疫苗的研制总是落后于病毒变异，造成现行的疫苗对当时的流行毒株预防效果不理想，这也是FMD防治困难重重的另一重要原因。随着对FMDV深入研究和知识的积累，已能从分子水平阐明病毒的基因结构和免疫特点，重组DNA及相关技术的兴起，推进了口蹄疫疫苗的研究，开拓了口蹄疫基因工程苗研究的领域，使新一代口蹄疫疫苗的诞生成为可能。

4.1 传统疫苗

4.1.1 活疫苗 FMDV容易发生变异，且不易致弱，有致病性，不安全，所以活疫苗不适宜用来防控FMD，目前世界上大多数国家已经禁止使用此苗。

4.1.2 灭活疫苗 目前FMD主要是使用灭活疫苗进行预防，且使用效果较其它类型疫苗效果好。由于活疫苗可能会因遗传变异导致原疫苗的效力丢失或突变成强毒株而引发疾病，死疫苗灭活不彻底导致疾病流行等原因，研制安全、稳定和抗原性强的新型疫苗便成为众多学者研究的热点。

4.2 新型疫苗的研制

4.2.1 基因工程亚单位疫苗 目前，已经发现FMDV结构蛋白基因和非结构蛋白基因2A、3C串联起来表达，可以产生76S的类病毒粒子，提纯该病毒粒子用来免疫动物，其免疫效果类似于全病毒，可产生高水平的中和抗体，能抵抗强毒的攻击，并彻底解决FMDV常规疫苗散毒的危险，显示其良好的前景。现只有A型FMDV基因工程疫苗试验证明具有相当的效力。目前我国已完成抗O型口蹄疫病毒基因工程疫苗的基因克隆和表达，用其制备的疫苗同时完成田间试验和区域性试验等一系列动物免疫试验，取得显著效果。

4.2.2 基因缺失疫苗 世界上第一个基因工程缺失苗是由美国的Baylor医学院和Texas大学联合研制成功的一株猪伪狂犬病基因缺失疫苗。受这一研究以及随后不同实验室成功结果的启发，许多研究者也开始致力于口蹄疫基因缺失苗的研究。

4.2.3 活载体疫苗 2000年，Berinstein A等[5]发现，结构蛋白前体基因构建的重组痘苗病毒免疫牛和小鼠后，用ELISA检测动物血清发现，中和抗体滴度高，抗病毒保护效果好，动物应答较强且持久，一次免疫诱导产生的抗体在体内可持续两个月，加强接种后，动物可获得更长的免疫力；另外，腺病毒和疱疹病毒也可以作为重组载体，Gregory A等[6]用表达FMDV结构蛋白的腺病毒-5型免疫猪，4周后用相同剂量加强免疫一次，可产生高滴度的FMDV中和抗体，5/6免疫猪获得了保护，用该重组病毒接种牛诱导产生高滴度的抗FMDV抗体。以复制能力缺陷第5型腺病毒介导的免疫由于转入本身缺乏复制机制，不会与宿主染色体基因整合，所以不会像弱毒疫苗出现毒力恢复的可能性。目前，腺病毒的基因结构与功能研究得比较清楚，而且腺病毒活疫苗已在美国使用30年，证明是安全的，所以重组病毒具有发展活疫苗的前景。

4.2.4 核酸疫苗 90年代，随着基因免疫概念的问世及完善，为FMDV免疫带来契机。Shieh等[7](2001)根据包含有非甲基化胞嘧啶-磷酸-胸腺嘧啶(CpG)基序的寡核苷酸(ODN)能够刺激细胞免疫反应，而且可充当有效的佐剂，因此构建了一个带有FMDV O/Taiwan/97株衣壳蛋白VP1的质粒DNA，并以CpG ODNs作为免疫刺激剂，结果证实用CpG ODNs 加强免疫后能够使小鼠产生更高滴度的中和抗体。除此之外，研究者还将FMD基因疫苗与IL-2,GM-CSF等细胞因子或携带其编码基因的质粒DNA共同免疫动物，结果证实这种方法大大提高了基因疫苗的免疫效力。核酸疫苗是用携带免疫原基因的核酸制成。美国梅岛动物病毒研究所正在研究口蹄疫病毒核酸疫苗，据称有一定的效果，但核酸疫苗安全性方面尚有许多需要探讨的问题，如染色体整合、免疫耐受、自身免疫和抗DNA抗体形成等诸多可能性。目前在动物试验中尚未出现这些现象，但是其安全性还需通过长期大量的观察和试验加以证实。

[1] Daniel Haydon,Susan Lea, Liz Fry,et al.Characterizing Sequence Variation in the VP1 Capsid Proteins of Foot and Mouth Disease Virus(Serotype O) With to Virion Structure[J]. J MOI 1998,Evol,46:465-475.

[2] Hamblin,et al.A new enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. Ⅱ.Application.J Immunol Meth, 1986, 93:123-129.

[3] Hamblin,et al.A new enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. Ⅰ.Evaluation on of antibodies after infection and vaccination.Epidemiol Infection,1987,99:733-744.

[4] 农业部畜牧兽医司. 家畜口蹄疫及其防制[M]. 北京: 中国农业科技出版社, 1994: 137-138.

[5] Berinstein A, Tami C, Taboga,et al. (2000).Protective immunity against foot-and-mouth disease virus induced by a recombinant vaccinia virus[J]. Vaccine.18: 2231~2238.

[6] Gregory A M, Marvin J G, Tarasvech C. (1999).Development of replication-defective adenovirus serotype V containing the capsid and 3C protease coding region of foot –and - mouth disease virus as a vaccine candidate[J]. Virology.263:496~506.

[7] Shieh H K.(1997). The FMD situation in Taiwan[J].J. Chin. Soc. Vet. Sci.23(5): 395~402.

（2012–07–23）

S852.65+9

A

1007-1733(2012)10-0089-03