莱姆病的实验室检查与诊断

杨清锐，于成成，杨杏林

(山东大学附属省立医院，济南 250021)

莱姆病(LD)是一种由伯氏螺旋体(Borrelia burgdorferi)感染引起的全身慢性传染病。伯氏螺旋体分为10个基因型，具致病性的3个基因型分别是伯氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)及阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)。北美流行的病原体主要是伯氏疏螺旋体，亚、欧洲则以伽氏疏螺旋体和阿氏疏螺旋体为主。

1 伯氏螺旋体实验室检查

伯氏疏螺旋体是单细胞疏松盘绕的左旋螺旋体，由表层、外膜、鞭毛和原生质柱四部分构成。其基因组由一个线状910 kb染色体和20多个5～56 kb的线状、环状质粒组成。鞭毛蛋白基因位于线状染色体，编码具有高度保守性的336个氨基酸序列，相对分子质量为41 ku，其肽链中央区域氨基酸组成为种特异性抗原表达位点，也是LD血清学诊断的抗原标志。OspA和OspB基因位于线状质粒，OspC基因位于环状质粒，亦是LD的主要抗原性外膜蛋白。伯氏螺旋体实验室检查主要分为病原体检测、血清学检测和分子生物学检测。

1.1 病原学检测 ①病原体直接镜检:LD患者血液、脑脊液、关节液、尿液等体液涂片可直接置于显微镜暗视野下镜检。游走性红斑、关节滑膜或淋巴结等组织活检切片则需经品红法等染色处理后镜检。此种常规的直接镜检法较为可靠，但受样本低含菌量限制易漏诊、病原体检出率极低，如能加做直接荧光抗体染色检查或可提高检出率。②病原体分离培养:采集LD患者血液、脑脊液、关节液等体液或组织标本加入MPK培养基培养，分离病原体并置于显微镜暗视野下镜检是诊断LD的“金标准”。但受伯氏疏螺旋体菌量少、培养周期长、实验操作条件要求严格、部分患者已进行抗生素治疗等因素影响，本法难以在临床常规开展。

1.2 血清学检测 LD血清学检测常用方法包括间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫蛋白印迹试验(Western bloting)等。目前国际上通用两步法诊断 LD，第一步采用IFA法或ELISA检测抗体，第二步采用Western bloting对阳性标本进行验证。①IFA试验:IFA法是最早应用于LD检测的血清学方法。靶抗原采用伯氏疏螺旋体的颗粒性抗原。我国和欧洲多采用的阳性结果判断标准如下:IFA检测单份血清如lgM抗体滴度≥1∶64、lgG抗体滴度≥1∶128，或检测双份血清抗体滴度大于4倍。本法操作简便易行，结果较为可靠。②ELISA:ELISA法试剂靶抗原包括B31菌株全菌超声波匀浆抗原、重组外膜蛋白抗原100 ku、41 ku及OspA、OspC等。其中，全菌抗原试剂因成分特异性不高，与梅毒螺旋体、钩端螺旋体等其他种属螺旋体存在交叉反应而逐渐被临床淘汰。纯化后的重组外膜蛋白抗原可一定程度上提高实验敏感性和特异性，优于IFA试验。ELISA法可检测出大多数LD急性期病例。另外，有研究发现神经系统LD患者脑脊液中抗LD抗体阳性检出率和滴度均高于血清，且脑脊液中的高滴度抗体提示神经鞘内存在着活跃的感染。③免疫蛋白印迹试验:此法因可分离不同的蛋白质并鉴定其相对分子质量大小而多被用于检测伯氏疏螺旋体特异性蛋白抗体，主要用于确认试验。2004年中国疾病预防控制中心(CDC)传染病预防控制所针对基因型伽氏疏螺旋体制定的标准如下:OspA、OspC、17 kD、30 kD、39 kD、58 kD、66 kD、83/100 kD中至少有一条蛋白带显色即可诊断IgG 阳性。OspA、OspC、17 kD、30 kD、14 kD、58 kD、83/100 kD中至少有一条蛋白带显色可诊断IgM阳性，41 kD显色者则须进一步作梅毒螺旋体和钩端螺旋体的鉴别诊断。

一般来说，分析上述血清学检查结果需注意以下几点:①LD感染早期或伴有免疫抑制患者可呈抗体检测阴性。②临床抗生素滥用致抗体检测阳性率降低。③可能和梅毒、钩端螺旋体、回归热等感染患者出现交叉反应而呈假阳性。④部分LD现症者及既往感染者难以区分。因此，临床应对LD患者血清进行双份(甚至动态)抗体滴度检测。

1.3 分子生物学检测 ①聚合酶链反应(PCR):本法多取用LD患者体液及皮肤、关节滑膜等受累脏器进行伯氏疏螺旋体特异性核酸片段检测。主要检测靶基因包括鞭毛蛋白p66编码基因、OspA编码基因、OspB编码基因、16S rRNA基因和5S/23S rRNA间隔基因区等。PCR法具有快速方便、灵敏度高、特异性强的优点。但本法有两点值得注意:一是PCR法的高敏感性对存在微量交叉污染的标本容易出现假阳性;二是PCR可从死菌中扩增DNA，其阳性结果并不一定提示有活菌感染。②反向线点杂交技术(Reverse line blot，RLB):本法主要检测靶基因是伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因间隔区序列，设计两对引物，其中一对引物的一条链用生物素标记，PCR扩增后再与设计的单链种特异性寡核苷酸探针进行杂交反应。此法具有高特异性和高敏感性。

2 LD诊断

LD的诊断需要根据流行病学资料、接触史、临床症状及实验室检查结果综合分析判断。目前临床多采用美国疾病控制中心提出的LD诊断标准，即符合下列任何1条者均可诊断为LD:①在流行区，有慢性游走性红斑(单个红斑的直径必须至少为5 cm，并应由医生检查确定)或抗伯氏疏螺旋体抗体滴度≥1∶256，及1个或1个以上器官系统受累。②在非流行区，有慢性游走性红斑及抗伯氏疏螺旋体抗体滴度≥1∶256，或有慢性游走性红斑及1个或1个以上器官系统受累，或抗体滴度≥1∶256及1个或1个以上器官系统受累。