流式微球技术及量子点在实验室诊断中的应用进展

胡晓璐，王占科

(1中国人民解放军第94医院，南昌330006;2南昌大学医学院)

实验室诊断是医学诊断的重要内容。随着生物化学、分子生物学、基因组学及蛋白组学的飞速发展，大量未知生物大分子不断被发现，实验室诊断面临着巨大的挑战。近年来，随着高分子微球技术和纳米量子点技术逐步用于实验室诊断，极大地提高了诊断的灵敏度，某些极微量生物大分子可以简便快速地被检测出来。现将流式微球技术及纳米量子点在实验室诊断中的应用进展情况综述如下。

1 微球

微球是直径为微米至纳米的固体颗粒，是一种性能良好的载体，在生物分离与纯化、细胞培养、临床诊断、药物缓释控制等方面具有良好的应用前景。微球可由多种材料构成，如聚苯乙烯、聚多糖类、二氧化硅、聚丙烯酸脂、聚丙烯酰胺等。目前应用最广泛的是聚苯乙烯微球［1］。聚苯乙烯微球具有机械性能好、吸附能力强、表面反应能力强、粒径均一、单分散性能好、制备方法简单、表面积大及表面弧度有利于抗原决定簇、抗体、核酸、菌体等结合位点的暴露而处于最佳的反应状态，从而提高实验室诊断的灵敏度，因此在生物化学、医学免疫学、临床检验学中得到很好的应用［2］。

免疫诊断微球是指微球偶联特异性抗体、抗原或核酸片段的微球。偶联抗体的微球可用于诊断相对应的抗原，偶联抗原的微球可诊断相对应的抗体，偶联核酸片段的微球可诊断互补核酸片段。免疫微球诊断试剂必须满足三个要求:①微球在液体中分散性好;②微球参与的凝集反应强;③微球反应特异性强。聚苯乙烯微球疏水性强，生物大分子的疏水部位非特异性吸附在微球表面，但这种非特异性物理性吸附的作用力不够强，因此在不影响单分散性的前提下，须对聚苯乙烯微球表面进行功能化修饰，使其表面带有羧基、氨基等能与抗原、抗体、核酸片段进行化学键偶联的官能团。功能化修饰可极大地增强结合牢固性，避免抗原、抗体、核酸片段的脱落和蛋白质交换现象。在众多功能化修饰官能团中，表面羧基化的微球与生物分子反应活性高，应用领域最为广泛。

2 流式微球技术(CBA)

CBA是将微球编码技术、荧光染料标记系统、流体学、激光技术、数据分析软件等整合在一起产生的一项新技术，该技术具有广阔的应用前景。传统的流式细胞术(FCM)是利用流式细胞仪对细胞或亚细胞结构进行快速分析和分选的技术。FCM与微球诊断技术相结合而产生的CBA与传统的FCM相比，其检测的数据和分析是通过微球表面上所携带的荧光信号来完成。该技术巧妙地将编码微球的特异性与FCM的高度灵敏性相结合，可同时测定液态体系中的多种可溶性蛋白、核酸及菌体成分，可同时获得多重信息的分析平台，具有所需样本量少、灵敏度高、特异性强、分析速度快、多通量同时分析等优点，其功能明显优于酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)、核糖核酸酶保护分析(RPA)等目前实验室诊断常用的生物分析方法［3］。Horejsh等［4］以不同大小的微球作为载体，利用分子信标技术及生物素—亲和素之间的特异性结合特点，在流式细胞仪上实现了对三种呼吸病原体核酸的检测。Summerbell等［5］用该技术对DNA上的碱基进行了微编码。李锦霞等［6］建立CBA检测血小板特异性自身抗体的方法，发现联合检测血小板多种抗体可以提高检测阳性率。王占科等［7］应用CBA与ELISA技术对人血清胰岛素进行检测，发现前者的可重复性、线性范围、灵敏度优于后者。

CBA在小分子物质，尤其在多组分高通量同时检测中优势显著。笔者所在实验室正在研发利用CBA检测小分子物质体系，有望建立实验室诊断分析的技术平台。

3 量子点(QDs)

生物体系既特殊又复杂，为了能同时测定更多的物质，对生物荧光探针有很高的要求:应当具有较好的光稳定性，不易被光解或发生光漂白;对生物体功能具有较小的影响;具有良好的激发和荧光效率;敏感性高;光谱特征突出等。目前，CBA一般都采用传统的荧光物质，但传统的荧光物质有较多缺陷:①激发光谱窄，发射光谱宽，具有较长的拖尾，容易造成谱峰之间的重叠。②易发生光漂白和光解现象，光解产物对生物分子具有杀伤作用，对活体细胞有一定的毒性作用。③生物分子与每种荧光染料偶联都需要特定的偶联方式，在高通量的生物分子的专一性的标识中有很大的局限性。近来出现的QDs成为当今国际上备受关注的崭新的纳米生物荧光探针，其克服了CBA的上述缺陷，具有很多传统荧光物质和稀土元素不可比拟的独特的光学性质。

QDs又称半导体纳米微晶体，其半径≤激子波尔半径［8，9］，粒径为1～100 nm，多由Ⅱ～Ⅵ组和Ⅲ～Ⅴ组元素所组成，主要有CdY(Y为S、Se、Te)，还有一些复合结构以及多层结构［10］。QDs是近年发展起来的一种新型荧光探针，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米微晶体。与传统荧光染料相比，QDs具有如下优点:①具有尺寸效应，QDs的粒径越小，其表面积越大，表面的原子就越多，表面束缚能就越大，吸收的能量也越大，吸收光谱蓝移现象越显著，即存在量子尺寸效应。②具有较大的斯托克斯位移(激发光与反射光之间的能量差)，发射光谱狭窄且呈高斯对称(通常半高全宽仅40 nm)，光谱之间较难重叠，可提高实验室诊断灵敏度、特异性。QDs具有较宽的激发波长［11］，对激发光源要求不高，可以用同一激发光源同时激发多种不同颜色的QDs。③具有较高的发光效率［12］。④具有良好的生物相容性，对机体危害小，细胞毒性低，而且与生物大分子的偶联方式相对简单易行，不像传统的荧光标记物，需要特定的偶联方式［13］。⑤发光性质可以调控。相同组分的QDs材料，可以通过调节粒径大小，获得从蓝光到近红光几乎所有可见波长的光。⑥光化学性质稳定性高，抗光漂白能力强，光褪色现象轻，可经过反复多次激发，不易发生荧光淬灭［14］，对生理代谢及化学物质降解均有很强的抵抗力。⑦具有灵活的表面化学、生物可塑性。

QDs经过功能化修饰，再与抗体或核酸片段耦联形成QDs荧光探针，可用于检测血液抗原或具有表面抗原的病原体、组织、细胞和核酸片段。基于QDs的荧光探针和诊断系统可广泛用于实验室诊断，有学者［15，16］将QDs与单克隆抗体通过生物素—亲和素系统形成生物素化单克隆抗体和亲和素化的QDs，利用双抗体夹心法对人血清标本中的前列腺特异性抗原进行检测。还有学者［17，18］利用链霉亲和素的QDs和生物素化的抗体作为探针对大肠埃希菌 O157∶H7进行检测，与异硫氰酸荧光素(FITC)相比，具有更高的灵敏度和更好的稳定性。Hu等［19］用 CdSe的 QDs实现了对细胞癌胚抗原(CEA)的检测。Yu等［20］用CdSe/ZnS的QDs偶联鼠抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体特异性识别AFP，QDs抗AFP抗体探针通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内，激光照射获取特异性分布的肿瘤部位。QDs荧光探针技术在实验室诊断中正发挥越来越重要的作用。

4 QDs荧光探针CBA

高性能QDs技术与CBA结合形成的QDs荧光探针CBA，为抗原、抗体、核酸片段等生物分子的实验室检测提供了新的方法。QDs荧光探针CBA是一种液态生物芯片技术，是一个高通量、高速率及多功能生物技术平台，可广泛用于免疫分析、受体和配体识别分析、酶学分析等研究，是实验室诊断以及生命科学研究中的一大热点。该技术的核心是对微球进行编码和QDs荧光探针的制备。目前，对微球的编码方式较多，有颜色编码、阻抗编码、粒径尺寸编码等。

微球荧光颜色编码主要是用不同浓度的传统荧光或不同粒径不同浓度的QDs对微球进行染色编码，形成不同颜色、不同荧光强度的微球。其工作原理主要为不同荧光颜色的微球编码不同的待测物质，荧光微球表面携带荧光探针强度代表待测物质的浓度。天津大学材料学院率先将QDs技术引入微球荧光颜色编码的液态生物芯片中，制备出不同粒径或不同浓度的QDs荧光颜色编码的微球和QDs荧光探针，已经用于肿瘤标记物的检测［21］。

阻抗编码微球CBA主要是利用阻抗作为物质的属性，从超导体到绝缘体，阻抗作为连续变量，其阻抗信息理论上趋于无限多。微球阻抗的无限性决定着阻抗编码微球CBA检测通量的无限性，理论上可对微球进行无限种的编码。笔者所在实验室发明的微球阻抗编码技术于2007年获得中国知识产权，其研究正在深入进行中，已取得初步的成果［22］。

粒径大小编码即根据微球粒径大小进行编码，也可实现多通量同时检测分析的目的。此编码要求微球粒径均一性好。不同粒径的微球编码不同的待测物质，通过流式分析，再对散点图区域及直方图进行统计分析，即可确认待测物质的种类及待测物质平均荧光强度值，平均荧光强度与待测物质的浓度成正比，根据标准曲线即可换算出待测物质的浓度。钱建瑞等［23］采用生物素化的羊抗兔IgG和QDs标记的链霉亲和素为荧光探针，建立了一种灵敏度高、选择性好的检测雌三醇的竞争免疫法。王楠等［24］采用羧基化的绿色QDs，通过羧基与禽流感单克隆抗体氨基共价结合，制备了测定禽流感病毒的QDs探针，并结合CBA，建立了QDs荧光探针CBA检测禽流感病毒的新方法。

综上所述，QDs与CBA快速发展，为实验室诊断提供了新的方法。QDs荧光探针CBA所需标本量少、灵敏度高、特异性强、分析速度快、方法简便，可多通量同时分析，在实验室诊断中展现出了广阔的应用前。

［1］Chang PC，Chung MC，Lei C，et al.Biocompatibility of PDGF-simvastatin double-walled PLGA(PDLLA)microspheres for dentoalveolar regeneration:a preliminary study［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100(11):2970-2978.

［2］Zhang Q，Han Y，Wang WC，et al.Preparation of fluorescent polystyrene microsphere by gradual solvent evaporation method［J］.Euro Poly J，2009，45(2):550-556.

［3］Li N，Boyd K，Dempsey PJ，et al.Non-cell autonomous expression of TNF-α-converting enzyme ADAM17 is required for normal lymphocyte development［J］.J Iumunol，2007，178(7):4214-4221.

［4］Horejsh D，Martini F，Poccia F，et al.A molecular beacon，beadbased assay for the detection of nucleic acids by flow cytometry［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(2):13.

［5］Summerbell RC，Levesque CA，Seifert KA，et al.Microcoding:the second step in DNA barcoding［J］.Philos Trans R Soc Lon B Biol Sci，2005，360(1462):1897-1903.

［6］李锦霞，杨炳华，何杨，等.流式微球技术检测血小板特异性抗体［J］.临床检验杂志，2010，28(2):110-112.

［7］王占科，何丹，祝仲珍，等.流式免疫微球技术定量检测人血清胰岛素方法学研究和评价［J］.免疫学杂志，2012，28(4):341-348.

［8］Rosenthal SJ.Bar-coding biomolecules with fluorescent nanocrystals［J］.Nat Biotechnol，2005，19(7):621-622.

［9］Dabbousi BO，Raddavanich J，Mikulec FV，et al.(CdSe)ZnS core shell quantum dots:synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites［J］.J Phys Chem，2007，101(46):9463-9466.

［10］何振宇，周培疆.量子点在生物医学医学检验中的应用及毒性研究进展［J］.中国卫生检验杂志，2009，19(12):3016-3018.

［11］Larson DR，Zipfel WR，Williams RM，et al.Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo［J］.Science，2003，300(5624):1434-1436.

［12］Dirks RW，Tanke HJ.Advances in fluorescent tracking of nucleicacids in living cells［J］.Biotechniques，2006，40(4):489-496.

［13］Zhang H，Yee D，Wang C.Quangtum dots for cancel diagnosis and thercipy:biological and clinical perspectives［J］.Nanomedicine (Lond)，2008，3(1):83-91.

［14］Wu X，Liu H，Haley KN，et al.Immunofluorescent labeling of cancer marker Her 2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots［J］.Nat Biotechnol，2003，21(1):41-46.

［15］Azzazy HM，Mansour MM，Kazmierczak SC.Nanodiagnostics:a new frontier for clinical laboratory medicine［J］.Clin Chem，2006，52(7):1238-1246.

［16］Kerman K，Endo T，Tsukamoto M，et al.Quantum dot-based immunosensor for the detection of prostate-specific antigen using fluorescence microscopy［J］.Talanta，2007，71(4):1494-1499.

［17］Hahn MA，Tabb JS，Krauss TD.Detection of single bacterial pathogens with semi conduct or quantum dots［J］.Anal Chem，2005，77(15):4861-4869.

［18］Yang L，Li Y.Simultaneous detection of escherichia coli O157: H7 and salmonella typhimurium using quantum dos as fluorescence labels［J］.Analyst，2006，131(3):394-401.

［19］Hu FQ，Ran YL，Zhou Z，et al.Preparation of bioconjugates of CdTe nanocrystals for cancer marker detection［J］.Nanotechnology，2006，17(12):2972-2977.

［20］Yu X，Chen L，Li K，et al.Immunofluorescence detection with quantum dot bioconjugates for hepatoma in vivo［J］.J Biomed Opt，2007，12(1):14008.

［21］张兵波，宫晓群，李卓权，等.用于疾病诊断的GdⅢ/量子点多模态成像探针的构建［J］.高等学校化学学报，2012，31(5): 982-985.

［22］Wang ZK，Hu T，Hu XL，et al.Coding by different diameter impedance，detection method of microspheres which are used to produce liquid biochip［J］.J Biosens Bioelectron，2012，3(1):111-113.

［23］钱建瑞，赵艳伟，梁艳，等.量子点标记链霉亲和素荧光免疫分析测定雌三醇［J］.分析实验室，2009，28(6):104-110.

［24］王楠，邹明强，汪明，等.禽流感病毒流式微球量子点探针免疫诊断新方法［J］.分析测试学报，2009，28(7):764-768.