重组DNA技术及其在动物科学中的应用

刘红珍 （山东省鄄城县畜牧局 274600） 李艳 （山东省胸科医院 济南） 李颖 （山东省济南动物疫病预防与控制中心）



重组DNA技术及其在动物科学中的应用

刘红珍 （山东省鄄城县畜牧局 274600） 李艳 （山东省胸科医院 济南） 李颖*（山东省济南动物疫病预防与控制中心）

DNA重组技术是基因工程的核心，指在体外条件下，将不同生物的基因进行入工“剪切”“组合”和“拼接”，使遗传物质重新构建，然后通过载体转入受体细胞内并使所需要的基因在受体细胞内表达，DNA重组技术涉及核酸分子杂交技术、PCR反应、限制性核酸内切酶等工具酶的应用、基因转移等多项技术方法，本文就该技术在实验动物科学中的应用作一综述。

重组DNA技术属于遗传工程分子水平的遗传操作，是一种按照人的意志定向改变生物遗传性状的技术。广义的遗传工程包括细胞水平的遗传操作(称为细胞工程)和分子水平的遗传操作(称为重组DNA技术)。狭义的遗传工程就是重组DNA技术[1]，重组DNA技术是在体外重新组合DNA分子(脱氧核糖核酸)，并使其在适当的细胞中增殖的遗传操作，这种操作可将特定的基因组合到载体上，并使其在受体细胞中增殖和表达。因此，它不受亲缘关系限制，为分子遗传学和育种学以及医学遗传学研究开辟了崭新途径。

1 重组DNA技术基本过程

1.1 用入工方法取得或合成目的基因 基因是含特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位，基因可被分离出来[2]。例如，从大肠杆菌中可将乳糖发酵基因分离出来。先利用两种有差异的亲缘关系相近的温和噬菌体分别感染两类大肠杆菌，噬菌体的DNA可与大肠杆菌的染色体发生整合。整合位置恰好都在含乳糖发酵基因DNA片段，但方向相反，整合到大肠杆菌中的噬菌体DNA得到复制，用紫外线刺激大肠杆菌，使带乳糖发酵基因的噬菌体，DNA可以从大肠杆菌染色体中脱出，形成带乳糖发酵基因的噬菌体。两种亲缘关系相近的温和噬菌体，通过加热使其DNA片段双链分开，形成单链DNA。进一步将两种噬菌体DNA单链混合在一起，根据碱基互补配对原则，互补的碱基配对成双链，不能配对的为单链。然后，用外切酶把单链DNA切断，单链被分解，保留了双链乳糖发酵基因。

基因的合成主要有化学合成和酶促合成两种方法。（1）化学合成：例如胰岛素，已知胰岛素分子由51个氨基酸组成，它可分为A链和B链，A链由21个氨基酸组成，B链由30个氨基酸组成，可用遗传密码推导出决定A、B链DNA上的碱基对排列进行入工合成。（2）酶促合成是利用限制性内切酶和逆转录酶获得DNA基因片段的方法。目前已从微生物中提纯出600多种限制性内切酶，其中常用的只有数十种，用这种酶可获得目的基因。真核生物，特别是高等动物和植物的结构基因是不连续的“间断基因”，即DNA可以在内切酶作用下被切断，无编码意义的内含子被酶分解；而有编码意义的外显子由连接酶连接并转录为mRNA，可利用逆转录酶得到有关的cDNA基因片段。这种基因片段，是不含内含子而只有外显子的cDNA。例如兔血红蛋白基因提取，就是利用逆转录酶作用于mRNA取得相应cDNA[2]。用上述方法也可以得到胰岛素、丝心蛋白等基因。

1.2 运载体的选择 运载体的作用是将分离或合成的基因导入细胞或能转移染色体上的DNA片段，所以必须能自由出入细胞，常用的载体有SV40病毒、温和噬菌体和质粒等，但最常用的是质粒。质粒是染色体以外能够自主复制的遗传单元，是由双链DNA分子组成，呈环状结构。可以游离于细胞浆中，也可与染色体整合在一起，没有蛋白质外套，是裸露的DNA分子，比染色体小，只带数个或数10个基因，最大的也只有大约100个基因，上面有一个位点称为原点，可以携带染色体转移。

1.3 质粒的分离与重组DNA 用溶菌酶裂解菌细胞分离出质粒。用内切酶处理质粒，使其DNA在一定位置上断裂，并在断裂口出现粘性末端。用同样的内切酶处理分离出的目的基因的DNA，使之具有相同的粘性末端与质粒粘性末端相连接，形成重组DNA稳定结构。将重组DNA导入不含质粒的细菌，即受体细菌中，例如大肠杆菌中，目的基因能随质粒复制而复制，并随细菌的分裂而扩增，形成这一基因的无性繁殖系重组DNA克隆化。

1.4 重组DNA的表达 在加入适量四环素的选择培养基上，例如抗四环素基因的质粒十胰岛素基因的重组DNA，可以在大肠杆菌中复制，扩增产生大量胰岛素。

2 核酸分子杂交技术及PCR反应在动物科学中的应用

2.1 实验动物微生物学检测 传统的方法多是以免疫学方法检测病原体抗原及其在动物体内产生的抗体，或者使用不同的方法分离培养微生物，有时存在灵敏度特异性低及速度慢等问题，有的病原体侵入机体后需潜伏一定时间后才出现抗体，用免疫学方法很难及时检测出来，一些持续感染却不能积极产生病毒颗粒的病毒，通过检测抗原的方法，难以检测到病毒，有的病毒的血清学检测只能确定是否接触过这种病毒，但不能肯定是否存在现行感染。核酸分子杂交技术可克服以上不足，并可用于动物群体的大量检测工作，其灵敏度很高，尤其是PCR反应，有时甚至存在一个病原体即可检出，其取材范围广，可从动物的血、尿、粪便、分泌物、体液、涂片、活检或尸解标本中直接检测，也可应用组织培养或细菌培养标本、组织切片检测。同时，目前已有大量的基因探针、寡核苷酸引物可供检测使用，运用这些探针、引物进行核酸分子杂交、PCR反应，可以对大量的病原体(病毒、细菌、寄生虫)进行检测。据不完全统计，在实验动物有关病原体方面，已进行了EB病毒、狂犬病毒、流行性出血热病毒、巨细胞病毒(CMV)、轮状病毒、细小病毒、腺病毒、慢病毒、鼠沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎支原体、弓形体等的应用研究[3，4]。YasukoK等对入工感染鼠肝炎病毒MHV-JHM小鼠的组织进行了PCR检测，小鼠腹腔接种病毒后仅ld，即可从感染鼠的肝及脑组织中扩增出其病毒核酸，而以ELISA法进行MHV抗体的检测，在接种后6d仍呈阴性，表明PCR是实验动物鼠肝炎病毒检测的敏感方法[5]。

2.2 实验动物遗传学检测 在生物进化过程中，由于各种原因引起DNA内核苷酸排列顺序改变，当这种改变涉及到限制性内切酶识别位点时，利用限制性内切酶可将DNA切割成不同长度的限制性片段。这些具有不同长度的限制性片段类型在人或动物群体中所呈现的多态分布现象就称为限制性片段长度多态性(RFLP)。RFLP在实验动物遗传孕研究中具有重要作用，可以据此绘制各品系动物的基因组限制性内切酶图谱，以研究各品系动物的起源、分化和血缘关系。史顺娣和王昔舟等分别对KM小鼠及我国自行培育的三种近交系小鼠(TA1、TA2、615)的线粒体DNA(mt DNA)进行了酶切电泳分析，其结果显示KM、TA1、TA2、615与DBA/2，C67BL/6的mt DNA内切酶图谱一致，表明它们具有相同的起源，即起源于欧州的野鼠Mus musculus domesticus[6,7]。引入注目的是DNA指纹分析法的出现使得RFLP的原理在近郊系动物品系的遗传学纯度及遗传学质量检测中得以应用。1985年英国遗传学家Jeffery等入在入体基因组DNA中发现了高度可变的小卫星区域，这些小卫星DNA的高可变区是由头尾相连的串联重复序列组成，其核心序列同源性很高，高可变区的一长度由于串联重复序列的重复次数不同而有很大的差别，这样的重复序列被命名为VNTR(Variable number of tandem repeat)，串联重复次数的不同，酶切割DNA的片段长度也不同，这些片断经小卫星DNA探针进行southern杂交后显示出丰富的RFLP。同一个体的不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同个体之间(除非同卵双生)谱带都不相同，如同入的指纹具有高度个体特异性一样。因此，这种southern杂交图被称为DNA指纹(finger pint)[7,8]。此项技术首先在法医学领域中应用于亲子鉴定及罪犯的确认，进一步研究发现小卫星DNA串联重复序列也存在于其它哺乳类动物基因组，且其核心顺序高度同源，这就为在品系内具有个体间基因型一致性的近交系动物遗传纯度检测提供了理论依据。Rbert J.Russell等利用DNA指纹分析对近交系大、小鼠进行了遗传学检测。其方法为从各品系动物的尾尖或肝提取DNA，经限制性内切酶酶切后，利用入源性的小卫星DNA核心顺序33.6作为探针，以Southern法进行杂交，其结果12个近交系大鼠品系均有自己独特的DNA指纹，而同一品系内各个体的DNA指纹相同。经生化标志物检测证实发生了遗传污染的近交系大鼠Lou/IaP的DNA指纹呈现变异。小鼠近交系品系间也具有自己独特的品系 DNA指纹，一些同源近交系间的DNA指纹可相互区别，但C57BL/6与CBA/ca的杂交F1的DNA指纹不能与C57BL/6区别。通过生化标志检测未能检测到疑为发生了遗传污染的MRI/MP-lpr小鼠的遗传变异，经DNA指纹分析后清楚地证实了其遗传污染。Tetsuo kunieda等利用人肌红蛋白小卫星DNA核心序列(MYO)作为探针，对近交系大鼠进行了DNA指纹分析，结果表明15个近交系大鼠品系间的DNA指纹完全不同，而同一品系内不同个体的DNA指纹完全相同。来源于同一品系内的两个亚系的DNA指纹也相同，表明动物经历数代繁殖后，DNA指纹仍呈现相对稳定。根据上述研究结果，研究者认为DNA指纹分析是近交系动物遗传学检测的一种简单、快速、有用的新型检测方法，具有良好的应用前景[11]。

3 转基因动物

基因转移是用物理的、化学的、生物的手段将外源基因导入受体细胞并使之表达的一种技术，它包括体细胞基因转移及生殖细胞基因转移，后者即为转基因动物的建立，故转基因动物(transgenic animal)是指那些在其基因组内稳定地整合进以实验方法导入的外源基因，并能遗传给后代的一类动物。转基因动物建立的技术过程依次为。分离编码某一目的产物的基因，或者分离对动物表型有作用的某一基因；制备DNA重组子使其能在选定的组织内表达，从而绕过正常存在于动物机体的代谢过程；将DNA重组子在体外转移至一个刚刚受精的单细胞卵中(导入方法包括微注射法、逆转录病毒感染法、精子载入法、电转移法、胚胎干细胞介导法)；经处理的卵重新植入适当的受体中；子代性状的分析[12]。转基因动物的研究虽然只有10多年的历史，但它取得的成就已举世公认，并越来越受到重视，转基因动物研究与不同学科的结合，开创了许多具有重大理论和应用价值的研究方向，解决了一些其它技术所不能解决的问题。下面列举几个方面来阐述转基因动物研究的意义及应用情况：（1）基因表达与调控；转基因动物为基因发育阶段性表达和组织特异性表达提供了一个极好的实验体系，将不同的基因片段重组子注射入受精卵，研究其在转基因动物中的整合表达，对证实某些DNA序列的作用是非常有用的手段[13]。（2）免疫学研究：利用转入19基因小鼠制备入单抗，使我们在制备入单抗时，不受抗原免疫的限制：导入人MHC基因为研究第I类和第II类组织相容性抗原的功能提供了新的手段[14]。（3）人类疾病模型的建立：如转入人Huntington舞蹈病基因的小鼠，可以产生舞蹈病；将BPV(DNA肿瘤病毒)导入的转基因动物中诱发了皮肤癌；用癌基因建立的转基因小鼠自发肿瘤，致瘤性可转递给后代；用乙型肝炎病毒基因建立的转基因小鼠组织中表达HBsAg mRNA；用HIV基因建立的转基因小鼠可出现HIV抗体、HIVg120外膜蛋白及逆转录酶等[15,16]。（4）动物优良品种的培育：将优良性状的基因导入动物生殖系，开辟了培育优良动物新品种的新途径。当首次将生长激素基因导入小鼠，得到了比原来个体大几倍的“超级小鼠”时[17]，也许人们就认识到转基因动物在遗传育种方面的划时代约意义。目前已经得到的转基因动物除小鼠外，还有转基因兔、羊、猪等，我国水生生物研究所朱作言等将人生长激素基因转入到鱼受精卵后，得到了转基因鱼，其个体比对照组有显著增加[19,20]。（5）作为生物反应器：在发育成的转基因动物体液或血液中收获基因产物，即所谓的“生物反应器”，如t-PA(纤溶酶原激活因子)是治疗血栓的一种有效药物，Westpllal等将该蛋白的基因修饰后，在建立的转基因小鼠分泌的乳汁中，检测到了人t-PA，除t-PA外，因子XII和a1抗胰蛋白酶也在转基因绵羊奶中得到了表达，羊奶的重要成份β－乳球蛋白也在其转基因小鼠的乳汁中表达[21]。

[1] 李汝棋. 中国大百科全书生物学分册(遗传学)[M]. 北京: 大百科全书出版社, 1983.

[2] 盛祖嘉. 分子生物学精要[M]. 北京: 科学出版社, 2004.

[3] 叶维萍, 黄原. 长PCR技术及其在动物学中的应用.动物学杂志, 2003, 38(3): 105-109.

[4] 余燕, 马金友, 陈金山. 犬细小病毒病的组织病理学观察[J]. 山西农业科学; 2007(4): 72-73.

[5] 邵伟娟, 高诚,陆国平等. 小鼠肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立和比较研究[J]. 中国实验动物学报, 2000, 8(1): 26-30.

[6] 姚玉霞,丛斌等. 逆转录－聚合酶链反应鼠肝炎病毒方法的建立[J]. 中国实验动物学报, 1998, 6(2): 13-17.

[7] 李华, 史小平. 近交系小鼠遗传监测方法及其研究进展[J]. 中国实验动物学杂志, 1996(4): 72-73.

[8]陈振文, 李瑞生, 王冬平等. DNA指纹图与生化标记分析对近交系小鼠遗传检测的比较[J]. 中国兽医学报, 2001, 21(6): 41-43.

[9] 李瑞生, 栾蓉晖, 张嘉保等. 近交系大鼠DNA指纹图稳定性的研究[J]. 动物医学进展, 2002, 23(1): 46-48.

[10]傅万海, 郝卫等. 聚合酶链反应标记轮状病毒地高辛素探针的初步应用[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 1998, 12(1): 77-79.

[11] 刘德立. DNA指纹图谱法在哺乳动物和鸟类遗传研究中的应用[J].动物学杂志, 1991, 26(4): 53-55.

[12] 孙红武等. 转基因动物在制药业的应用与开发[J], 动物科学与动物医学, 2003(12): 43-45.

[13] 尹春光. 转基因动物的检测方法[J]. 生物学杂志, 2005(1): 37-39.

[14] 张然等. 转基因动物的研究现状及发展前景[J]. 中国生物工程杂志, 2005, 25(8): 16-24.

[15] 余兵, 王永坤, 朱国强. 应用核酸斑点杂交法检测鹅细小病毒(GPV)[J]. 中国兽医学报, 2002, 22(9): 453-454.

[16] Nudsch, J. P. F., Christensen, J., Rommelaera, J. Initiaton of Minute Virus Mice DNA replication is regulated the level of origin unwinding by protein kinaseC phosphorylation of NS1 [J].Viol. 2001，75: 5730 - 5739.

[17]高明. 轮状病毒基因重配研究现状[J],微生物学免疫学进展, 1996, 29 (4): 67-69 .

[18]段天林, 孙以方, 张文慧等. DNA指纹技术在近交系动物遗传检测中的研究[J]. 中国兽医科技, 2005,(3): 24-26.

[19] 庄树文, 吕东云. 银龙鱼抗病育种技术[J]. 水产养殖, 2007, 28(5): 25-26.

[20]颜景斌, 肖艳萍, 陈美珏等. 红系特异的GFP基因在转基因小鼠中的整合和表达[J]. 动物学报; 2004, 50(2): 263-268.

（2012–09–20）

S813.3

A

1007-1733(2012)12-0090-03