MicroRNA研究方法进展

王平 （山东省泰安市岱岳区畜牧兽医局 271000）



MicroRNA研究方法进展

王平 （山东省泰安市岱岳区畜牧兽医局 271000）

miRNAs是一类内源性、约22个核苷酸长度的非编码RNA，具有稳定的特异性序列以调节基因表达。2001年，miRNAs作为线虫生长发育过程中的调节器而被发现，在病毒、植物和动物体中，miRNAs已被公认为主要的调控基因家族之一，通过mRNA靶向作用降解或抑制其翻译。

小RNA在生物进化过程中高度保守，并已被证实参与和调控包括时序发育、细胞凋亡脂肪代谢、神经元发育、细胞分化、激素分泌等在内的多种生理过程，以及包括肺癌、白血病在内的多种疾病发生过程[1]。目前，对小RNA表达的鉴定主要依靠以杂交、PCR、生物芯片的方法；对靶标的确定，主要依靠生物信息学方法；对其功能线索的获得，则主要依赖于在特定细胞或动物模型内外源性抑制或表达相应的小RNA基因，再通过报告基因系统验证后检测特定细胞或动物模型发育过程中的生化或分子变化来实现，并同时利用报告基因系统对小RNA的靶基因进行验证。在此笔者对经典的及最新发展的研究小RNA的技术方法作简要的总结和概述。

1 miRNA基因鉴定

1.1 遗传学方法

正向遗传学的原理是把突变的基因从产生非正常表型的生物体或者组织当中分离出来，进行研究鉴定。而反向遗传学则在体外引入特定的突变，然后把已突变的基因放回到原来的宿主当中，而且常常是通过同型基因化或换位放回到宿主中原来的位置上，从而观察表型的改变。在研究miRNAs的时候，反向遗传学分析方法常常与生物信息学分析相结合，对可能的miRNAs基因进行预测，然后运用反向遗传学分析方法引进突变，观察表型，从而对基因进行定位。

1.2 分子生物学方法

1.2.1 miRNA克隆 不同的小RNA克隆方法的原理基本一致：首先，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA片段，回收20-25 ntRNAs。接着，将筛选的RNA分子，连接到3’和5’的适配子上，逆转录并通过PCR扩增，获得miRNAs 的cDNA文库，然后对这些cDNA进行克隆、测序，再结合生物信息学软件进行分析。在进行miRNAs和适配子连接前通常要进行以下处理：miRNA去磷酸化、合成3’适配子时把3’末端羟基与非核苷酸基团连接，屏蔽羟基、或者在合成3’适配子时把3’末端在多聚腺苷酸酶的作用下增加poly(A)尾巴[2]。

1.2.2 Northern杂交 PAGE及随后的Northern杂交，为小RNA检测提供了简便而可靠的方法。Northern杂交不仅具有高灵敏的特点，还能结合使用RNA marker检测小RNA的分子大小，这对于排除其它小分子RNA的污染有重要意义。Northern杂交也可作为miRNA定量的方法，只需将已知浓度梯度的寡核苷酸对照物与待测样品进行平行杂交即可[3]。

1.2.3 基因芯片(microarray) 对miRNAs表达水平高通量分析的最普遍的方法是使用寡核苷酸微阵列[4]，在大样本的研究中，使用这种方法能够同时测量成百上千miRNAs的基因表达。另外一种微阵列方法叫作微流引物延伸检测Microfluidic Primer Extension Assay(MPEA)，这种检测方法以Febit Geniom®微阵技术的使用为基础，miRNA在高度灵敏的微阵列杂交前，不需要标记。接着，DNA聚合酶I的Klenow片段直接加入微量流动芯片的通道中，相应的miRNA得以特异延伸。此方法将杂交检测的特异性与酶延伸的高辨别能力相结合[5]。

1.2.4 实时定量PCR 与杂交方法相比，PCR方法可以高度灵敏地检测出低丰度表达的靶分子，并适于高通量筛选。PCR扩增简要过程如下：首先将纯化的小分子量RNA与引物混合，经变性、复性过程使引物与模板配对；然后，加入包含逆转录酶、底物、DTT以及RNA酶抑制剂的混合物，逆转录生成cDNA；再以cDNA为模板，进行实时定量PCR。

2 miRNA靶标鉴定

2.1 计算机预测

绝大多数的miRNAs都是通过碱基配对的方式结合到靶mRNA的3’非翻译区，从而抑制其翻译，达到调控基因表达的目的。因此靶标的鉴定对研究miRNA的功能至关重要。随着生物信息学和计算机在生物研究应用的发展，很多实验室都建立了靶标鉴定的计算机方法，计算机预测的靶标具有可靠性、可验证性的优点。

到目前为止，根据不同标准已经建立了很多计算机程序筛选法(附表)。2003年，Stark和同事通过程序对黑腹果蝇全基因组搜寻鉴定潜在的miRNA靶标首先得到成功[6]。

附表 已建立的靶标预测方法

MethodType of methodRefsMethod Availa-bilityData Avail-abilityResource http:// Stark et al.Complementarity[7]Online searchYeswww.russell.embl.de/miRNAs/ miRandaComplementarity[8]DownloadYeswww.microrna.org/ miRanda miRBaseComplementarity[9]Online searchYesmicrorna.sanger.ac.uk/ TargetScan Seedcomplementarity[10]Online searchYeswww.targetscan.org/ DIANAThermodynamics[11]Dow-nloadYesdiana.pcbi.upenn.edu/ PicTarThermodynamics[12] Yespictar.bio.nyu.edu/ RNAHy-bridThermodynamics and statistical model[13]Dow-nload bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/ miTargetSVMe[14]Online Search cbit.snu.ac.kr/ miTarget/

2.2 miR-TRAP技术

miR-TRAP技术是最新发展的技术。操作miR-TRAP可分为三个基本步骤，首先通过共轭补骨脂素(一种可通过光激活的植物分子)生成针对目的miRNA的高度光反应探针，第二步完成长波紫外线光交联反应，第三步拉下(pull down)RNA，并用RT-qPCR对其进行分析。换句话说，利用紫外线光杀死细胞，将miRNA/mRNA双双冷冻在适当的位置。随后从细胞中抽提出RNA，可以进一步检测结合mRNA序列，揭示miRNA的靶基因。

3 miRNA功能的研究

3.1 小RNA抑制

目前，主要有两种方法可以阻断小RNA的作用：一是敲除小RNA基因或其在靶基因上的结合位点，二是小RNA的序列特异性抑制。由于分子大小的限制，小RNA基因直接敲除的方法并不实用。所以，研究者多使用反义寡核苷酸抑制剂来阻断小RNA的作用[15-17]。这种抑制剂是体外化学合成，能与特异性小RNA完全互补的反义RNA。在借助转染试剂进入目的细胞后，能快速并稳定地与内源性成熟小RNA分子互补结合，从而阻止了内源性小RNA分子与靶基因配对。

3.2 小RNA的过表达

与常规mRNA的功能研究相似，小RNA的过表达研究也是研究小RNA功能的一种主要方式。可以通过构建小RNA表达载体，或体外直接合成小RNA前体，转入目的细胞两种方式来实现。前者由于可获得稳定的过表达细胞株而应用较为普遍。在前一种方式中，通常先从基因组中扩增小RNA基因及其旁侧序列，然后将其克隆入逆转录病毒或腺病毒载体，最后感染目的细胞观察功能效应[18,19]

3.3 小RNA的报告基因系统

小RNA的报告基因系统，是小RNA研究中一种常用的辅助手段，它常被用于检测单个小RNA的抑制情况及验证小RNA的靶基因。当使用序列特异的抑制剂抑制细胞内的特异小RNA时，常同时转入3′UTR区含有该小RNA互补序列的报告基因载体，来验证小RNA的作用是否被阻断[20]。同样，为了验证预测的靶基因是否被小RNA所抑制，可将预测靶基因的小RNA互补位点或3′UTR序列克隆入报告基因序列的下游，然后通过分析报告基因的表达情况，来验证靶基因预测的正确与否[21,22]。

4 前景和展望

自从第一个miRNA被发现以来，此类非编码小RNA成为研究的热点。短短几年，miRNA的研究从发现、认识miRNA分子到了解其功能和作用机制。近年来对miRNA的研究已经取得了突破性进展，并且有大量的miRNA被鉴定，许多实验室都开发了miRNA基因鉴定，靶标鉴定计算机鉴定方法。miRNA微芯片技术可以作为实现高通量检测的手段，但必须有大量的已知miRNA作为基础。生物信息学分析技术是高通量研究miRNA的有效手段，但是结果具有不确定性，需要常规分子生物学方法做辅助验证。在实际研究中将常规分子生物学方法和生物信息学分析技术联合使用，发挥各种方法的优势。为预测更多miRNA，并鉴定其靶标，确定其功能，需要我们把生物信息学、分子生物学、生物化学以及遗传学等学科的研究方法结合起来。

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（2012–09–05）

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1007-1733(2012)12-0084-03