全身热应激预处理对大鼠肠缺血—再灌注损伤程度的影响及机制

王丹妹，何 佟，吉丽敏，翁 阳，莫燕娜

(海南医学院，海口571101)

研究证明经典的热应激预处理(42℃)可诱导热休克蛋白(HSP)表达增加，对肠缺血—再灌注损伤(IR)有保护作用［1］。但其他温度热应激预处理肠IR的影响尚不明确。2010年7月～2011年12月，我们观察并比较了38.5～39℃、40～40.5℃、41.5～42℃全身热应激预处理后大鼠肠黏膜HSP水平、Caspase-3活性及肠黏膜细胞凋亡情况。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 SD雄性大鼠50只，体质量200～230 g，购自于河南省实验动物中心，随机分为5个组。A组为正常体温+假手术对照组，B组为正常体温+肠IR组;C组为38.5～39℃热应激+肠IR组，D组为40～40.5℃热应激+肠IR组，E组为41.5～42℃热应激+肠IR组。

1.2 试剂与设备 鼠抗诱导型HSP70(HSP72) mAb(SPA-810)(美国Stressgen公司);鼠抗β-actin mAb(南京建成生物工程研究所提供);DAB显色试剂(武汉博士得生物工程公司);细胞凋亡原位末端标记法(TUNEL)试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司);Caspase-3 Colorimetric Assay(购自美国R＆D公司)。Stat Fax-2100型酶标仪(美国AWARENESS);光学显微镜(日本Olympus)。

1.3 全身热应激预处理方法 大鼠用3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉。C组置于45℃恒温水浴箱中，使其肛温在20 min内达到38.5～39℃，然后移至事先已经调温好的39℃水浴箱中并维持10 min;D组置于50℃恒温水浴箱中，使肛温20 min内达到40～40.5℃，维持10 min;E组置于55℃恒温箱中，使肛温在20 min内升至41.5～42℃，维持10 min，取出置室温24 h;A组和B组不进行热应激预处理。

1.4 大鼠肠缺血—再灌注损伤模型制作方法 大鼠预先禁食12 h，但可自由饮水。用3%戊巴比妥钠(1.5 mL/kg体质量)进行腹腔注射麻醉。取正中切口，分离出肠系膜上动脉(SMA)，室温静置10 min。B、C、D、E组用微动脉夹夹闭系膜上动脉，30 min后轻轻取出动脉夹，自然恢复血液重新灌流。A组只分离但不夹闭SMA。

1.5 肠道组织形态学观察方法 自然恢复血液再灌注60 min及相应时点，从肠道回盲部近端距回盲瓣10 cm处剪取约2 cm长度的小肠标本，放入盛有中性甲醛溶液中固定，备以后做常规病理切片用，用HE染色方法进行染色，观察肠组织形态学变化。

1.6 肠黏膜HSP72水平、Caspase-3活性、细胞凋亡率检测方法 从距回盲瓣12 cm处截取约3～4 cm长度的小肠，置预冷的生理盐水中，纵向剖开，轻柔漂洗2～3次，然后刮取肠黏膜置于EP管中，放置－80℃冰箱贮存备用。①HSP72水平。采用Western Blot法。提取肠黏膜蛋白，考马斯亮蓝(Bradford)法进行蛋白定量。采用Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺(100 g/L)凝胶进行电泳，电泳后转至PVDF膜上，以20 g/L牛血清白蛋白封闭后，一抗封闭4 h以及辣根过氧化物酶标记的二抗封闭1 h，以β-actin作为内对照，DAB显色。采用Scion Image软件进行计算HSP72的灰度值与β-actin的灰度值，检测各样本中HSP72表达水平(即HSP72灰度值/β-actin灰度值)。②细胞凋亡率。采用原位末端缺口标记法(TUNEL)。操作按试剂盒说明书进行。在高倍显微镜下见胞核呈棕褐色的细胞为凋亡细胞。随机计数5个高倍视野内凋亡细胞数和总细胞数，细胞凋亡率 =凋亡细胞数/总细胞数 ×100%。③Caspase-3活性。采用比色法。操作严格按试剂盒说明书进行。用Stat Fax-2100型酶标仪读取各孔吸光度值(波长为405 nm)，计算出样本的Caspase-3活性值(即样本孔的吸光度值－对照孔的吸光度值)。

1.7 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。结果以±s表示，组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠道组织形态学变化 B组见有固有层破坏，出血;C组损伤程度比B组轻，见部分绒毛顶端破损;D、E组肠黏膜损伤程度更轻，仅出现绒毛顶端上皮下间隙增大或绒毛轻度水肿。

2.2 肠黏膜HSP72水平 A、B、C、D、E组大鼠肠黏膜组织HSP72水平分别为0.40±0.09、0.26± 0.09、1.08±0.11、1.39±0.23、2.72±0.88。C、D、E组肠黏膜组织HSP72水平高于A、B组(P均＜0.05);E组肠黏膜组织HSP72水平明显高于C、D组(P均＜0.05)。

2.3 肠黏膜上皮细胞凋亡率 A、B、C、D、E组大鼠肠黏膜组织细胞凋亡率分别为4.60%±1.12%、35.53% ±3.40%、21.10% ±3.11%、7.50% ± 1.88%、6.60%±1.83%。肠黏膜细胞凋亡率D、E组比B组降低(P均＜0.05);C组与B组相比虽数值略有降低，但P＞0.05;D、E组相比，P＞0.05。

2.4 肠黏膜Caspase-3活性 A、B、C、D、E组大鼠肠黏膜组织 Caspase-3活性分别为1.22±0.14、2.72±0.55、1.33±0.24、1.41±0.30、1.16±0.30。C、D、E组大鼠肠黏膜组织Caspase-3活性与B组相比明显降低(P均＜0.05)，D组与E组、D组与A组、E组与A组相比，P均＞0.05。

3 讨论

从最简单的原核生物到复杂的生物体乃至人类，各种应激因素都会诱导细胞内保护性分子HSP的表达增加［2，3］。目前的研究表明，HSP是一组非特异性细胞保护蛋白，具有多种功能。因应激诱导机体表达热休克蛋白，可以耐受其他不利因素对机体细胞的损伤［4］。诱导型HSP(HSP72)可以作为应激反应的标志，是HSP中最受关注的一种［5］。

本研究中我们用不同温度(39、40、42℃)对大鼠进行不同强度的全身热应激处理，检测肠黏膜HSP72的表达，结果发现不同强度热应激处理，均能诱导HSP72蛋白表达水平增加，在3个温度范围内，呈现随着处理温度的升高肠黏膜HSP72蛋白表达水平增加的线性改变，以E组最显著。实验结果与在人A549肺内皮细胞中的观察结果一致［6］。

肠IR是临床常见的各种组织器官损伤之一，在肠移植、严重创伤、感染、应激等疾患的病理演变过程中起重要作用［7］。目前认为肠IR与细胞凋亡密切相关［8］。本研究中笔者通过夹闭—松开肠系膜上动脉的方法复制肠IR模型，结果显示IR组肠黏膜上皮细胞凋亡率和Caspase-3活性值显著增高，说明成功建立了肠IR模型。

本研究结果显示，经全身热应激处理的大鼠在IR后肠黏膜形态学的改变较未经热处理组有不同程度的减轻，肠黏膜上皮细胞凋亡指数和肠黏膜细胞Caspase-3活性也呈现不同程度的下降，以D、E组改善明显。表明不同强度的全身热应激处理对肠IR均有保护作用，这种保护效应与热应激诱导HSP72蛋白的表达水平有关。与以往的研究结果［7］一致。以往的研究认为可诱导性HSP的表达增加可增强细胞抗凋亡作用［10］。HSP70能抑制通过Fas传导通路诱导的Caspase-3、8的活化而防止细胞凋亡［11］。HSP72的保护效应体现在对凋亡上游通路的阻断［12～15］。此外本研究结果显示，D、E组大鼠肠黏膜形态学、细胞凋亡率和Caspase-3活性差异不大，这是否提示肠黏膜HSP72的表达达到一定水平即达到最大的保护效应，其机制还有待进一步研究阐明。

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