肝癌组织血管内皮生长因子与受体的表达及其临床意义

周 辉，牟洪超，孙 茂，董立军

在肝癌的治疗中，手术切除被认为是首选的方法，虽然术后配合介入治疗、微波治疗、射频消融、生物免疫疗法等，但肝癌的病死率仍然很高，术后转移和复发是影响患者术后长期生存的首要原因。大量研究表明肿瘤血管生成是恶性肿瘤生长、浸润和转移的重要病理基础[1]，而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 是血管形成的关键因子，VEGF通过与血管内皮生长因子受 体 （vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）结合后使受体磷酸化激活细胞内信号传导通路而实现促血管形成效用。肝癌组织中癌细胞依靠丰富的新生血管网快速生长，并通过血管网在肝内发生侵袭和转移。近年许多研究已发现VEGF在肝癌组织中广泛表达，促进血管形成，促进肝癌复发转移[2]。本文通过免疫组化检测肝癌手术切除标本VEGF及VEGFR，分析它们与肝癌的临床病理特征及术后生存率的联系，以了解它们对肝癌术后复发、转移的影响及评估预后，为预防肝癌术后复发、转移及提高术后生存率提供更多方法。

1 资料与方法

1.1 病例资料 本组76例为在笔者所在医院肝胆外科2004-03～2007-12住院的手术患者，均为首次手术，术后病理证实为原发性肝细胞癌，术前未行放、化疗或介入治疗，术后均依据不同病情行1~2次介入治疗，术后至少随访2年以上，开始2年内1~3个月随访1次，以后6~12个月随访1次，最长已随访5年，生存时间从手术之日起开始计算。男59例，女17例；年龄34~61岁，平均48.7岁。有乙肝病史者69例，丙肝病史者3例，无肝炎者4例；合并不同程度肝硬化64例，无明显肝硬化12例；术前肝功能均为Child-A级；术前AFP>400 ng/L 59例，AFP≤400 ng/L 17例；增强CT扫描检查发现肿块位于肝右叶43例，左叶27例，左内与右前叶交界部位4例，尾状叶2例；肿块单发69例，有2~3个病灶者7例 (6例为局限于1叶或1段内，1例为右后叶及左外叶各1个病灶)；有门静脉转移者9例，形成胆管癌栓者3例，术后病理证实伴肝段或肝叶内微小灶转移灶者12例，所有76例术前检查均排除远隔转移；肿块直径>5 cm者61例，≤5 cm者15例；肿瘤界限清楚存在假包膜者41例，界限不清无明显包膜或包膜不完整35例；术后病理检查高分化19例、中分化36例、低分化21例。

1.2 免疫组化染色 VEGF、VEGFR测定：选取肝癌手术标本中无坏死的部分以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋。组织蜡块切片、脱蜡，免疫组化法试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司），严格按试剂盒操作流程说明进行操作。鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人VEGFR单克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂盒、二抗试剂盒均为北京中杉金桥生物技术公司产品，采用免疫组化SP法做VEGF和VEGFR两种免疫组化检测，VEGF和VEGFR工作浓度均为1∶50，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。

1.3 结果判定 VEGF表达主要见于肿瘤细胞浆中，为胞浆内棕黄色粗大颗粒，部分胞膜也有表达，间质细胞及血管内皮细胞表达较少；VEGFR主要在血管内皮细胞表达，而肝癌细胞浆呈弱阳性表达。参照文献运用高倍镜（@200）于染色密集区每片随机计数3个视野，每视野计分为阳性细胞染色强度和阳性细胞率的得分之和：无染色0分，弱染色（浅黄）1分，中等染色（棕黄）2分，强染色（棕褐色）3分；阳性细胞率<5%计0分，5%~25%计1分，26~50%计2分，>50%计3分。各视野得分的平均值作为最终得分：0分为阴性，1~2分为弱阳性，3~4分为中度阳性，5~6分为强阳性，并把阴性和弱阳性合并作为阴性结果，而中阳性及强阳性合并作为阳性结果[3]。本组76例中无阴性表达，故将弱阳性作为阴性统计。

1.4 统计学分析 采用SPSS11.5统计分析软件处理数据。寿命表法计算无瘤生存率，单因素生存时间对比分析采用对数秩和检验，计量资料采用t检验，计数资料及两因素相关采用χ2检验。

2 结 果

2.1 肝癌患者手术2年后无瘤生存率 全部76例术后随访2年以上，无失访者，术后1年有29例复发，术后2年复发19例，按寿命表法计算术后第1、2年累计平均无瘤生存率分别为61.85%±5.57%、40.97%±5.63%。

2.2 分析肝癌术后生存时间的影响因素 临床中影响肝癌患者术后生存时间的因素很多，根据临床实际情况主要分析年龄、性别、有无肝硬化、有无病毒性肝炎、术前AFP水平、术前肝癌在肝内是否转移、肿块大小、肿块数目、肿块包膜情况、肿瘤分化程度和VEGF、VEGFR的表达水平与术后生存时间的关系，先逐个做单因素分析对数秩和检验，经统计学分析发现性别、年龄、病毒性肝炎、肝硬化、术前AFP水平及肿瘤分化程度对术后生存时间影响无统计学差异；而VEGF、VEGFR阳性表达和术前肝内转移情况、肿块大小、肿块数目、肿瘤有无假包膜对生存时间的影响有统计学差异（P<0.05）。

2.3 VEGF、VEGFR与转移、肿块体积、肿块数目及肿瘤包膜之间的相互关系 将免疫组化染色的标本与已知阴性片对照比较，发现VEGF阳性表达61例，阳性率80.3%，VEGFR阳性表达67例，阳性率88.2%。对肝癌术后生存时间有明显影响的六项指标中，肝癌体积大小、转移情况、有无包膜与VEGF、VEGFR的阳性表达密切相关 （P<0.05）， 说明VEGF、VEGFR阳性表达者能促进血管快速形成，加速肿瘤生长，增加肿瘤的侵袭性，并促进转移。

2.4 VEGF、VEGFR的表达与术后2年复发的关系将术后第1、2年后复发患者的VEGF、VEGFR表达的情况进行χ2检验，以了解之间的关系，经统计分析发现VEGF、VEGFR的阳性表达与术后复发密切相关（P<0.05），说明 VEGF、VEGFR 阳性表达者术后复发或转移的可能性明显增大，无瘤生存时间短。

2.5 VEGF、VEGFR表达的关系 将VEGF、VEGFR的表达情况进行相互比较分析，应用χ2检验发现VEGF、VEGFR的表达相互之间具有相关性 （P<0.05），说明在肝癌组织中VEGF、VEGFR二者之间的表达具有相互促进作用。

3 讨 论

正常情况下，VEGF在人体内维持在一个较低水平，在生理需要的情况下，如胚胎形成、骨骼生长等时VEGF表达增加，促使血管快速形成，满足机体的生长发育，但在病理状态下，如肿瘤的形成过程中肿瘤细胞也表达大量的VEGF，形成血管网，以促进肿瘤的快速扩展和蔓延。这种情况在肝癌组织中表现的更加显著，临床及病理均已证实肝癌是一种富血管肿瘤，在肝癌组织中存在大量的肿瘤新生血管。大量资料表明VEGF是肿瘤血管形成的关键生长因子，在肝癌组织中呈现高表达，VEGF表达程度与肝癌组织内微血管密度一致，并在肝癌生长、侵袭和转移过程中发挥重要的作用[4]。在本组76例中无阴性表达，VEGF呈阳性表达有61例，阳性率80.3%，比其它文献结果略高[2，4]，估计可能与样本选择、样本数大小、检测方法、对照标准等不同有关，但结论还是一致。在本组肝癌组织中VEGF呈高表达，笔者推测VEGF阳性表达越强，肿瘤新生血管网越多，肿块生长越快，本组61例阳性表达患者中有56例为直径>5 cm者，笔者考虑这种VEGF高表达促血管生成及肿瘤生长的作用可能是肿瘤在快速生长过程中由于肿块缺血缺氧诱导刺激癌细胞通过自分泌和旁分泌途径表达大量VEGF的缘故，这与其它文献报道相符[1，2]，其余15例统计为阴性者其实也呈现弱阳性表达，但大部分是直径<5 cm的患者，术前影像学检查即显示为少血供肿瘤，这也从另一面说明了这一点。

原发性肝癌号称为“癌肿之王”，主要是从肝癌的生物学行为角度说的，因肝癌恶性度高，侵袭性强，术后易于复发、转移，因而长期生存率低。近年来对于肝癌复发的预测做了大量研究，有许多指标可以用于预测复发和生存时间，除了一些临床及病理特征对肝癌术后复发及生存时间的影响可以作为预测项目外，VEGF作为预测指标正日渐得到临床的认可[6]。本文资料显示VEGF、VEGFR阳性表达和术前肝癌的肝内转移情况、肿块大小、肿块数目、肿瘤有无包膜等因素对复发和生存时间的影响明显，而肿瘤大小、转移情况、有无假包膜等与VEGF、VEGFR的阳性表达相互之间也密切相关，说明VEGF、VEGFR高表达能促进血管快速形成，加速肿瘤生长，促进转移，统计全组复发情况时发现术后2年内复发患者与VEGF、VEGFR的阳性表达紧密相联，存在显著的相关性，据此并结合其他文献研究结果得出结论VEGF、VEGFR是影响肝癌发展方向的重要因素之一，可以作为术后预测复发的重要指标。

在肿瘤组织中VEGF、VEGFR是通过自分泌和（或）旁分泌途径，联合调控肿瘤组织血管内皮细胞分裂增殖和血管形成的，并且VEGF、VEGFR的表达相互关联。VEGF和VEGFR类型虽多种多样，但许多研究发现肝癌组织中VEGF的表达主要是VEGF165，主要分布于肝癌细胞浆内，VEGFR表达以VEGFR-2为主，主要分布在巨噬细胞和肿瘤血管的内皮细胞上，只有二者结合才能产生促血管形成、促进肿瘤复发转移的效应[1，4]。通过本组76例肝癌标本的研究笔者发现VEGF的表达主要见于肝癌细胞浆中，免疫组化染色为胞浆内棕黄色粗大颗粒，部分胞膜也有表达，间质细胞及血管内皮细胞表达较少，而VEGFR主要在肝癌组织的血管内皮细胞表达，癌细胞浆仅呈弱阳性表达，并且在61例VEGF阳性患者与67例VEGFR阳性患者中，有56例同时呈阳性表达，因此笔者认为VEGF诱导的血管生成和肿瘤生长、复发转移过程中与VEGFR在肝癌组织血管内皮细胞上的表达也是密切相关的。

总之肝癌的生长离不开持续和广泛的血管生成，抑制新生血管可能成为治疗肝癌的另一种有效的新方法。由于VEGF的表达与血管生成和肝癌细胞生长都密切相关，因而抑制和阻断肝癌细胞所分泌的VEGF的生物活性对遏制肝癌生长和转移，提高肝癌术后生存时间等方面有重要意义。

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