利用木薯酒糟液培养枯草芽孢杆菌的工艺优化

梅雪臣，黄加军，曹玉飞，熊儒先，刘超帝，缪礼鸿*

（1.武汉工业学院 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.广西中粮生物质能源有限公司，广西 北海 536100）

木薯酒糟液是以木薯为原料发酵生产酒精蒸馏后的废醪液，其COD达50000mg/L～100000mg/L，治理难度较大。酒糟中含有丰富的蛋白质和18种氨基酸，还有未被利用的脂肪、纤维素和酵母菌体等营养成分[1]。因此，对其进行开发利用，不仅能解决酒糟的污染问题，还能变废为宝，实现资源的二次利用[2]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是我国农业部允许作为饲料添加剂的安全益生菌之一，因其具有抗逆性强、代谢过程中可产生大量的蛋白酶、淀粉酶等有益因子现已在饲料领域得到广泛的应用[3-4]。枯草芽孢杆菌还能有效降解水体中的氨氮和亚硝酸盐等有害物质而具有净化水质的作用，在养殖水体的生物修复方面具有广泛的应用[5]。

高效、廉价的液体发酵培养基微生物制剂产业化的基础。通过培养基及培养条件的优化以提高液体培养的活菌数对微生物制剂的生产具有重要意义[6-8]。本研究以枯草芽孢杆菌为研究对象，通过单因子和正交试验对以木薯酒糟液为基础的液态发酵培养基及其培养条件进行优化，为木薯酒糟液的资源化利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：枯草芽孢杆菌BA1即水产养殖用枯草芽孢杆菌，为市购的某公司生产的商品化菌种，主要用于水产养殖；解淀粉芽孢杆菌T1和枯草芽孢杆菌A6由武汉工业学院资源与环境微生物研究室提供。

木薯酒糟液（pH4.2，COD 85000mg/L）：由广西中粮生物质能源有限公司提供。

复合氮源营养液：含有机氮和氨基酸态氮，总氮含量9.70%。

1.2 培养基

1.2.1 木薯酒糟基础发酵培养基

木薯酒糟液100%，pH 6.0。115℃灭菌30min。

1.2.2 木薯酒糟发酵培养基

木薯酒糟液98.8%，1.0%蔗糖，0.10%蛋白胨，0.10%（NH4）2SO4，pH 6.0。115℃灭菌30min。

1.2.3 牛肉膏培养基

牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，水1000mL，pH 7.2～7.4。

1.2.4 碳源基础发酵培养基

木薯酒糟液99.0%，蔗糖1.0%，pH 6.0。115℃灭菌30min。

1.2.5 氮源基础发酵培养基

木薯酒糟液99.9%，蛋白胨0.10%，pH 6.0。115℃灭菌30min。

1.3 种子液的制备

将活化好的芽孢杆菌接种到牛肉膏液体培养基中，37℃、170r/min摇床培养24h。

1.4 活菌数测定方法

采用稀释平板涂布计数法，菌悬液涂布于牛肉膏固体培养基平板后于37℃恒温培养24h计数菌落数。

1.5 不同芽孢杆菌发酵酒糟液

采用木薯酒糟发酵培养基，调节培养基pH值至6.0。按5%接种量分别接种水产养殖用枯草芽孢杆菌BA1、解淀粉芽孢杆菌T1、枯草芽孢杆菌A6 种子液，培养温度37℃，37℃、170r/min摇床培养24h，取样测定培养液中芽孢杆菌的活菌数。并分别以木薯酒糟基础培养基和牛肉膏培养基作为对照。

1.6 单因子试验

1.6.1 发酵时间对芽孢杆菌菌数的影响

采用木薯酒糟发酵培养基，调节培养基至pH值为6.0。按5%接种量接种枯草芽孢杆菌BA1种子液，37℃、170r/min摇床分别培养18h、21h、24h、28h，取样测定不同培养时间培养液中枯草芽孢杆菌的活菌数。

1.6.2 培养基pH值对水产养殖用枯草芽孢杆菌菌数的影响

采用木薯酒糟发酵培养基，用40%NaOH分别调培养基pH值至5.0、5.5、6.0、6.5，按5%接种量接种枯草芽孢杆菌种子液，37℃、170r/min摇床培养24h，测定各不同pH值培养液中枯草芽孢杆菌的活菌数。

1.6.3 接种量对枯草芽孢杆菌菌数的影响

采用木薯酒糟发酵培养基，调节培养基至pH值为6.0。分别按3%、5%、7%、10%接种量接种枯草芽孢杆菌种子液，37℃、170r/min摇床培养24h，测定不同接种量条件下培养液中的活菌数。

1.6.4 不同碳源对水产养殖用枯草芽孢杆菌活菌数的影响

选择蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和糖蜜4种碳源分别加入氮源基础发酵培养基中，添加量均为1%。按5%接种量接种枯草芽孢杆菌BA1种子液，37℃、170r/min摇床培养24h，测定各培养液中枯草芽孢杆菌的活菌数。

1.6.5 不同氮源对枯草芽孢杆菌活菌数的影响

选择蛋白胨、硫酸铵、尿素和复合氮源营养液4种氮源分别加入碳源基础发酵培养基中，添加量均为0.1%。按5%接种量接种枯草芽孢杆菌BA1种子液，37℃、170r/min摇床培养24h，测定各培养液中草芽孢杆菌的活菌数。

1.7 正交试验

通过上面单因子试验，选择2种氮源（尿素、复合氮源营养液）及2种碳源（葡萄糖、蔗糖）和3个浓度添加水平，采用L9（34）正交试验法（表1）确定最佳培养基配方。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.8 离心干燥测活菌数

枯草芽孢杆菌BA1发酵菌液经4000r/min离心5min，弃上清得到离心沉淀菌体，取少量离心菌体进行稀释平板测活菌数；剩余菌体经55℃恒温干燥箱烘干、粉碎后制备成固体菌剂，并取样测活菌数。

2 结果与分析

2.1 不同芽孢杆菌发酵酒糟液

采用木薯酒糟发酵培养基分别培养枯草芽孢杆菌BA1、A6菌株及解淀粉芽孢杆菌T1菌株。由表2可知，解淀粉芽孢杆菌T1在牛肉膏种子液中的菌数最高为11.2×108cfu/mL，而水产养殖用枯草芽孢杆菌BA1在木薯酒糟发酵液中的菌数最高为14.3×108cfu/mL。因此选定BA1菌株为后续试验的发酵菌种。3株芽孢杆菌在不补加任何外源营养的木薯酒糟基础培养基中的菌数均较低，因此，需要对以木薯酒糟液为基础的发酵培养基进行优化，以便获得更高的发酵活菌数。

表2 不同芽孢杆菌发酵酒糟液菌数比较Table 2 Viable counts of different Bacillus strains grown in cassava lees wastewater medium

2.2 单因子试验

2.2.1 发酵时间对枯草芽孢杆菌菌数的影响

利用木薯酒糟发酵培养基，比较不同发酵时间对枯草芽孢杆菌BA1菌数影响。结果表明（图1），发酵24h时BA1的活菌数最高，达17×108cfu/mL。因此，培养时间为24h为宜。

图1 发酵时间对枯草芽孢杆菌BA1菌数的影响Fig.1 Effect of fermentation time on viable count of B.subtilis BA1

2.2.2 培养基pH值对枯草芽孢杆菌菌数的影响

由图2可知，培养基的pH值为6.0时枯草芽孢杆菌BA1的活菌数最高，为最适宜生长的pH值，pH5.0、pH5.5和pH 6.5时的培养基活菌数明显偏低。

2.2.3 种子菌悬液接种量对枯草芽孢杆菌菌数的影响

不同接种量的试验表明（图3），培养，接种量为5%时枯草芽孢杆菌BA1的活菌数最高，接种量为3%时BA1活菌数最低。接种量为5%、7%、10%时BA1的活菌数相差不大，但是考虑到经济成本问题接种量为5%已经可以满足发酵要求，因此最优接种量为5%。

图2 培养基p H值对枯草芽孢杆菌BA1活菌数的影响Fig.2 Effect of pH value on viable count of B.subtilis BA1

图3 接种量对枯草芽孢杆菌BA1活菌数的影响Fig.3 Effect of inoculum on viable count of B.subtilis BA1

2.2.4 不同碳源对枯草芽孢杆菌活菌数的影响

向木薯酒糟基础培养基中分别补加4种碳源的试验结果（图4）表明，葡萄糖和蔗糖作为木薯酒糟液培养基的补充碳源最适宜芽孢杆菌BA1的生长，活菌数相对于糖蜜和可溶性淀粉高很多。

图4 碳源对用枯草芽孢杆菌BA1活菌数的影响Fig.4 Effect of carbon source on viable count of B.subtilis BA1

2.2.5 不同氮源对枯草芽孢杆菌活菌数的影响

向木薯酒糟基础培养基中分别补加4种氮源的试验结果表明（图5），添加复合氮源营养液时BA1活菌数最高，为最佳氮源。分别添加尿素和蛋白胨的培养基活菌数相当，但尿素的使用成本更低，因此正交试验选择复合氮源营养液和尿素作为补加氮源。

2.3 正交试验优化结果

采用L9（34）正交试验确定枯草芽孢杆菌BA1最适发酵培养基配方。由表3可知，极差R值的大小分别为C＞B＞A＞D，即对枯草芽孢杆菌生长影响由大到小依次为葡萄糖、复合氮源营养液、尿素和蔗糖。

图5 氮源对枯草芽孢杆菌BA1活菌数的影响Fig.5 Effect of nitrogen source on viable count of B.subtilis BA1

表3 正交试验结果与分析Table 3 Result and analysis of orthogonal test

通过直观分析和方差分析，理论上A3B1C2D1的组合为最优方案，但在9个试验号中都没有出现，正交表中A3B3C2D1的活菌数在9个试验中最高，其次是A2B1C2D3。因此，选择A3B1C2D1，A3B3C2D1，A2B1C2D3的组合进行验证试验，同时用牛肉膏培养基作为参比培养基，每个处理3次重复。由表5可知，A3B1C2D1的活菌数最高，达35.0×108cfu/mL，而牛肉膏液体培养液活菌数仅为12.0×108cfu/mL，其活菌数是牛肉膏液体培养基活菌数的2.9倍。与表2中数据比较，A3B1C2D1的活菌数分别为木薯酒糟基础发酵培养基和未优化的木薯酒糟发酵培养基中活菌数的9.46倍和2.45。因此，枯草芽孢杆菌BA1的最佳补料配方为葡萄糖2.0%，复合氮源营养液0.10%，尿素0.30%，蔗糖1.0%。

2.4 离心干燥测数结果

按A3B1C2D1培养基配方发酵BA1，发酵液离心后测得新鲜离心沉淀菌体的活菌数为60×108cfu/g；离心沉淀菌体的含水率为84.0%。菌体经干燥、粉碎后得到的枯草芽孢杆菌菌剂实测活菌数为140×108cfu/g，与新鲜离心沉淀菌体的总菌数相比，干燥后菌剂的活菌数存活率明显偏低，其原因有待进一步研究分析。

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test

表5 验证试验（为3 次重复的平均值）Table 5 Verification experiment (Average number of 3 repeats)

3 结论

用木薯酒糟培养水产养殖用枯草芽孢杆菌BA1菌株，其最优培养基配方为木薯酒糟液96.6%，葡萄糖2.0%，复合氮源营养液0.10%，尿素0.30%，蔗糖1.0%，pH为6.0。最优培养条件为温度37℃，摇床170r/min培养，培养24h。发酵结束后培养液中枯草芽孢杆菌BA1活菌数可达35.0×108cfu/mL，分别为木薯酒糟基础发酵培养基和优化前的木薯酒糟发酵培养基中活菌数的9.46倍和2.45倍。发酵菌液经离心、干燥后得到枯草芽孢杆菌BA1菌剂的活菌数达140×108cfu/g。

[1]程抱奎.开发酒糟资源节省饲料用粮[J].粮食与饲料工业，1999（3）：30-31.

[2]闫国栋，姜丽艳，王秀丽，等.利用浓醪酒糟生产乳链菌肽的发酵培养基优化[J].酿酒科技，2009：33-36.

[3]葛 龙，章亭洲，赵 艳.饲用枯草芽孢杆菌液体培养差的筛选与优化[J].饲料研究，2011（6）：22-24.

[4]姚小飞，叶 璐，赵世敏.枯草芽孢杆菌的选育及其发酵豆粕的工艺条件研究[J].安徽农业科学，2010，38（16）：8476-8478，8490.

[5]刘 颖，丁桂珍，胡传红，等.枯草芽孢杆菌对养殖水体水质影响研究[J].淡水渔业，2004，34（5）：12-14.

[6]郝林华，孙丕喜，姜振波，等.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）液体发酵条件[J].上海交通大学学报：农业科学版，2006，24（4）：380-385.

[7]姚翠萍，王和玉，杨 帆，等.枯草芽孢杆菌液态培养条件优化及其代谢产物分析[J].酿酒科技，2010（8）：43-45.

[8]张卫兵，宋 曦，贺晓玲，等.Bacillus licheniformis产凝乳酶培养基的优化[J].中国酿造，2011（2）：70-73.