酸中毒条件下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响

毛胜勇，何文波，朱伟云

（南京农业大学动物科技学院，江苏 南京210095）

＊瘤胃急性酸中毒及亚急性酸中毒是反刍动物突然或长期采食高精料而带来的一类瘤胃代谢异常疾病。瘤胃酸中毒给畜牧生产带来了巨大的经济损失，为预防该病的发生，减少因其带来的危害，人们在生产中常应用包括缓冲剂、电子受体、乳酸菌临床疫苗和莫能菌素等手段来阻止或减缓瘤胃中毒的发生或发展过程［1－3］，但上述添加剂的使用效果欠理想，在一些大型牧场，瘤胃酸中毒仍是当前反刍动物养殖中的主要疾病之一。因此，寻求可有效预防与治疗瘤胃酸中毒的技术手段也一直备受动物营养学者关注。

阿卡波糖是一类用于治疗Ⅱ型糖尿病（非胰岛素依赖型）的药物，其主要通过抑制淀粉酶和葡萄糖苷酶的活性而减缓单糖的生成速度［4］。近年来有报道表明，该药物可用于提高奶牛瘤胃内p H值，治疗急性酸中毒［5，6］。但综合相关进展，目前该方面的报道仍较少，一些基础数据仍不充分，如阿卡波糖对瘤胃微生物发酵不同饲料原料的效果是否一致、日粮底物与阿卡波糖之间是否存在互作效应，在急性或亚急性酸中毒条件下，添加阿卡波糖对发酵参数的影响程度是否一致，这些问题都不清楚。为较充分地阐明阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响，本研究应用批次培养技术，以混合日粮或单一原料为底物，在体外模拟急性或亚急性酸中毒条件下，研究了不同阿卡波糖用量对瘤胃微生物发酵的影响，拟为人们在生产中应用该药物来预防及治疗酸中毒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、动物饲养及瘤胃液的获取

阿卡波糖（Acarbose）购自江苏省南京军区总医院。

试验选用4头装有永久性瘤胃瘘管的本地成年公山羊，单圈饲喂，以玉米（Zeamays）、豆粕和羊草（Leymus chinensis）为主的精粗比例为4∶6的日粮预饲1周，每天8：00和20：00饲喂，自由饮水。实验当日，于饲喂后2 h分别从4头山羊的瘤胃内抽取其内容物，放入充满CO2的塑料瓶内。在厌氧条件下，将所获瘤胃液经4层纱布过滤后，搅拌30 s混匀，而后与预热至39℃的厌氧培养基混合，瘤胃液与厌氧培养基的体积比为1∶2。

1.2 培养基的组成及配置

培养基的 组 成 及 配 置：292 mg K2HPO4、240 mg KH2PO4、480 mg （NH4）2SO4、480 mg NaCl、100 mg MgSO4·7H2O、60.1 mg CaCl2·2H2O、4 000 mg Na2CO3，加水至1 L，培养基通CO2至基本无色后，添加600 mg半胱氨酸盐酸，继续通 CO2至完全无色［7－9］。

1.3 实验设计

本实验于2010年4－6月进行，实验重复2次。

1.3.1 混合日粮条件下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响 实验设空白组、对照组和处理组。处理组中的阿卡波糖添加量分别为0.1，0.2和0.4 mg／m L；空白组不添加底物和阿卡波糖；对照组不添加阿卡波糖。各组均设置4个重复，底物均为0.8 g玉米＋0.2 g羊草（过40目筛）。每瓶接种40 m L培养基和瘤胃液的混合液，39℃下培养24 h。培养期间，每隔3 h用气压计平衡气压以保证发酵的正常进行，发酵至终点后，冰浴终止发酵，立即测定p H值，并收集上清液，冻存于－20℃冰箱内，备测氨氮、乳酸和VFA（volatile fatty acid，VFA）浓度等。

1.3.2 不同精料原料底物条件下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响 精料分别为高粱（Sorghumbicolor）、玉米、大麦（Hordeumvulgare）和小麦（Triticumaestivum）（0.45 mm），各底物称取1 g，阿卡波糖添加量为0，0.1，0.2，0.4 mg／m L，其他条件同1.3.1，39℃体外培养24 h后取样备测同1.3.1指标。

1.3.3 模拟急性酸中毒下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响 采用体外批次培养，将瘤胃液和39℃培养基混合液（体积比为1∶2）60 m L分装于120 m L发酵瓶中，发酵底物为0.75 g玉米（0.45 mm）、0.25 g纤维二糖、0.25 g甘露糖和0.25 g木糖，阿卡波糖添加量为0，0.1，0.2和0.4 mg／m L，实验各处理均设4个重复，发酵瓶用乙丁基橡胶塞密封后以铝盖封口，随后置于39℃培养箱中培养24 h，结束后取样备测指标，取样方式、保存方法和指标测定同1.3.1和1.3.2。

1.4 指标测定

氨氮测定参照 Weathburn［10］；乳酸测定参照张龙翔等［11］；VFA 测定参照秦为琳［12］。

1.5 数据统计

数据经Excel 2003初步处理之后，1.3.1和1.3.3结果分析采用SPSS 16.0统计软件中One－way ANOVA分析，1.3.2数据采用 General Linear Model（GLM）分析，显著性水平置于0.05。

2 结果与分析

2.1 混合日粮条件下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响

与对照相比，添加阿卡波糖极显著提高了发酵液p H值、乙丙比、异丁酸和戊酸浓度（P＜0.001），乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和TVFA浓度极显著降低（P＜0.001），其中0.4 mg／m L阿卡波糖组的p H值提高了25%（表1）；乳酸浓度下降了98%；但对异戊酸浓度无显著影响（P＝0.794）。与对照相比，阿卡波糖处理组的氨氮浓度显著升高（P＜0.001），各处理组的氨氮浓度较对照提高3倍以上。随阿卡波糖添加量的逐渐增加，除异戊酸外，阿卡波糖对其他指标的影响呈线性效应和二次方效应。

2.2 不同精料原料条件下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵影响

添加阿卡波糖极显著提高了4种底物下发酵液的p H值和氨氮浓度及乙丙比（P＜0.001）（表2），其中0.4 mg／m L阿卡波糖组的p H较对照组上升了17%（高粱）、20%（玉米）、18%（大麦）和21%（小麦），且底物与阿卡波糖间存在显著的互作效应（P＜0.001）；添加阿卡波糖极显著降低了发酵体系中的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸和TVFA浓度（P＜0.001），除乙酸和TVFA外，日粮与阿卡波糖间在影响其他指标上存在显著的互作效应（P＜0.05）。

2.3 急性酸中毒下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响

与对照相比，添加阿卡波糖皆极显著提高了发酵液p H值、丙酸和戊酸浓度（P＜0.001）（表3），显著提高了氨氮和丁酸浓度（P＜0.05），极显著降低了乳酸浓度（P＜0.001），显著降低了乙丙比（P＜0.05），其中0.4 mg／m L阿卡波糖组的p H值提高了6.4%，乳酸浓度下降了98%；但对乙酸、异丁酸、异戊酸和TVFA浓度无显著影响（P＞0.05）。随阿卡波糖添加量的逐渐增加，阿卡波糖对乳酸、乙酸和戊酸浓度与p H的影响呈线性效应和二次方效应（P＜0.001），但对氨氮、丙酸、丁酸、戊酸和乙丙比仅呈线性效应（P＜0.05）。

表1 阿卡波糖对p H、乳酸、氨氮及总挥发性脂肪酸及其组成的影响Table 1 Effects of acarbose addition on the p H，lactate，NH3－N，TVFA production and its composition in in vitro fermentation

3 讨论

3.1 混合日粮条件下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响

本研究显示，添加阿卡波糖可有效提高发酵液p H值，降低乳酸及VFA含量，说明阿卡波糖可有效地抑制瘤胃微生物活力，结合其用于治疗Ⅱ型糖尿病的作用机制，推测阿卡波糖可能通过抑制瘤胃微生物发酵过程中产α－糖苷酶和α－淀粉酶的活力，进而减缓瘤胃微生物对多糖的酶解速度，从而减缓瘤胃p H值的快速下降［4］。Mc Laughlin等［5］研究发现，与Na HCO3和莫能菌素相比，添加阿卡波糖更显著的提高了急性酸中毒试验中奶牛瘤胃p H，有效缓解了瘤胃中乳酸的累积。Speight和Harmon［13］体外研究发现，与对照组相比，每kg日粮中添加1.2～9.5 mg的阿卡波糖能有效阻止p H的下降和VFA的累积。本实验结果表明，添加阿卡波糖降低了乙酸、丙酸和丁酸浓度，并显著减少了TVFA产量，提高了乙丙比，结果与上述报道基本一致。Marta等［14］研究发现，在高产泌乳奶牛日粮中添加0.75 g／d阿卡波糖能有效地减少瘤胃p H＜5.6的持续时间，乳酸产生菌包括牛链球菌和乳酸利用菌埃氏巨型球菌在总菌中的比例下降。本研究表明，阿卡波糖可显著降低乳酸含量（下降比例高于92%）。由于乳酸是反刍动物急性酸中毒的主要诱因，并主要由牛链球菌及乳酸杆菌等发酵生成［15］；因此，综合上述报道，阿卡波糖可能通过抑制牛链球菌的数量来减少乳酸生成，从而阻止乳酸的大量累积。同时，瘤胃中的乳酸可通过丙烯酸途径生成丙酸，因而乳酸生成量可直接影响丙酸产量。本研究发现，虽乙酸与丙酸浓度皆极显著下降，但乙酸的下降幅度低于丙酸，其可能原因与丙酸的2条生成途径（琥珀酸与丙烯酸途径）皆受到极显著的抑制有关，这也是导致乙丙比反而增高的根本原因；本研究还发现，较对照组相比，异丁酸和戊酸的浓度反而有所增高，由于异丁酸和戊酸主要由瘤胃微生物发酵支链氨基酸生成，这一迹象是否暗示阿卡波糖具有促进支链氨基酸的分解效应，目前尚不清楚，需进一步研究。

表2 以玉米、高粱、大麦及小麦为底物时添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响Table 2 Effect of acarbose on the p H，NH3－N，VFA and its composition in vitro fermentation with sorghum，corn，barley，wheat used as substrate

表3 急性酸中毒下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响Table 3 Effect of acarbose addition on actuate rumen acidosis

3.2 不同精料原料条件下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响

本实验中，在不同原料条件下，阿卡波糖皆显著提高了发酵液的p H值，降低了乙酸、丙酸、丁酸和TVFA浓度，结果与Speight和Harmon［13］报道一致。研究表明，由于谷物类饲料的淀粉含量与淀粉类型组成不一，瘤胃微生物对不同的谷物底物的发酵速率也不一致，日粮中谷物饲料发酵速度越快，越易引发瘤胃酸中毒［16］。据Leonard［17］报道，与玉米比较，麦类谷物最易造成绵羊或奶牛酸中毒，本实验中，就各底物的对照而言，24 h发酵终止时，大麦和小麦组的乙酸、丙酸及TVFA浓度皆高于玉米和高粱组，结果显示麦类谷物发酵速率最快，该结果与Leonard［17］报道一致。本研究显示，虽大麦和小麦皆是发酵速度较快的谷物，但小麦组的丁酸浓度低于其他组。Lettat等［18］报道，瘤胃微生物发酵小麦易生成乳酸，而发酵玉米易生成丁酸，因此，小麦组丁酸浓度较低与其底物类型有关。本研究同时阐明，阿卡波糖对各种底物条件下VFA及乙丙比的影响幅度不同，添加0.2 mg／m L的阿卡波糖，高粱、玉米、大麦和小麦的丙酸浓度较对照组分别下降了82.33%，78.58%，70.63%和71.34%（P＜0.01）；丁酸浓度相应降低了84.62%，83.96%，75.55%和60.95%（P＜0.01）；TVFA 浓度相应降低了58.64%，65.43%，53.52%和46.58%（P＜0.01）；乙丙比相应提高了4.72，2.41，1.56和2.31（P＜0.01），该结果显示，阿卡波糖对以高粱和玉米为底物的发酵体系的影响较大，其具体原因可能与所用谷物原料组分的具体含量有关，在本研究所用的4类谷物中，玉米的淀粉含量最高，但小麦淀粉的发酵速率最高，互作分析结果表明，底物与阿卡波糖间存在互作效应，该结果也进一步证实了阿卡波糖对这些指标的影响程度与日粮底物有关。

3.3 急性酸中毒下添加阿卡波糖对瘤胃微生物发酵的影响

据报道，在体外发酵中，当发酵液精料浓度达到并超过20 g／L时，培养体系中发酵液的p H值低于5.0，乳酸浓度高达10 mmol／L，该值与动物生产中发生急性酸中毒时的p H值及乳酸浓度大致相当［19－21］。在本研究中，除阿卡波糖的添加浓度为0.4 mg／m L组外，其余各组的p H值均低于5.0，乳酸浓度皆高于10 mmol／L，说明该体系可模拟瘤胃急性酸中毒；结果显示，阿卡波糖可显著降低各处理的乳酸浓度，提示该药物具有预防瘤胃急性酸中毒发生的潜力。但本研究也发现，使用阿卡波糖显著提高了发酵体系丙酸、丁酸和戊酸浓度，推测可能与发酵终点较低的p H值有关。在本研究中，发酵结束时，对照组的p H值为4.66，而阿卡波糖处理组的p H均在5.0左右，由于瘤胃微生物对低p H极其敏感，因此，较对照组相比，阿卡波糖处理组的一些参与丙酸和戊酸生成的微生物可能仍具有较高的活性，结果导致处理组中的丙酸和戊酸浓度等较高。但遗憾的是，本研究未及时检测发酵体系中微生物菌群结构的变化，因此本研究仅能提供一种假说，即在急性酸中毒条件下，阿卡波糖可能通过影响瘤胃p H间接影响瘤胃微生物区系结构，进而影响发酵产物的组成及产量。这一假说是否正确，尚需后续工作验证。

4 结论

本实验在体外模拟亚急性瘤胃酸中毒和急性瘤胃酸中毒条件下，发现添加阿卡波糖均显著提高了发酵液p H值，降低了乳酸浓度，在以玉米、小麦、高粱和大麦为底物的条件下，阿卡波糖对玉米和高粱发酵参数的影响程度最大，在影响p H、氨氮、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸浓度和乙丙比上，日粮底物与阿卡波糖之间存在显著的互作效应；急性酸中毒下，添加阿卡波糖对TVFA无显著影响。结果显示，阿卡波糖能减缓瘤胃微生物发酵谷物类饲料的速率，有预防与治疗瘤胃酸中毒的潜力。

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