海滨雀稗体细胞突变体SP2008－3的特异性分析

常盼盼，钟小仙，刘智微

（1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京210014；2.南京农业大学动物科技学院草业科学系，江苏 南京210095）

＊海滨雀稗（Paspalumvaginatium，Seashore paspalum）为禾本科（Graminea）雀稗属（Paspalum）植物，原产于美洲，分布于世界热带、亚热带，尤其美洲热带之海岸，为潮间带草滩植被的主要组分，能在复杂的逆境条件下生长，其抗性主要表现在耐盐、耐涝、抗旱、耐践踏等方面，是目前已知耐盐能力最强的草坪草种。其叶色翠绿，景观效果优于狗牙根（Cynodonspp.）和假俭草（Eremochloaophiuroides），已成为21世纪最具发展潜力的暖季型草坪草种［1－7］。美国较早开展了海滨雀稗品种的选育工作，20世纪末海滨雀稗品种Adalayd从美国引进中国，1998年自深圳的观澜湖高尔夫球场引至江苏省，试种结果表明，Adalayd能生长在全盐含量为0.8%～1.0%的滨海盐土，海水短期淹没、较长期浸泡均能忍受，抗寒性强，综合性状优，在江苏省连云港以南地区可自然越冬。邹轶等［8］及景艳霞和袁庆华［9］系统研究了海盐胁迫对海滨雀稗Adalayd生长及植株体内阳离子含量的影响，初步明确了盐胁迫下海滨雀稗不同于紫花苜蓿（Medicagosativa）的阳离子积累规律。邹轶等［10］系统研究了海盐胁迫对海滨雀稗Adalayd植株形态和生长的影响，并进一步明确了Adalayd对海盐胁迫的生理响应，在此基础上，在江苏省和浙江省新围垦海涂，初步建立了海滨雀稗Adalayd种茎直播和草块直铺技术体系，因其耐盐性强、景观效果好，在长江中下游及其以南地区正在备受关注。但由于海滨雀稗Adalayd与其他二倍体海滨雀稗种质一样，由于自交不亲和［11，12］，只能以无性繁殖方式扩繁，明显影响海涂大面积草地建植以及沿海开发区大面积厂区和边坡地绿化的成本。

截至目前，全世界只有一个商品化种子直播型海滨雀稗杂交品种“Sea Spray”（Q36313×Hyb－7），由美国纯种子测试机构（Pure Seed Testing）与乔治亚大学研究基金会（University of Georgia Research Foundation）合作培育而成［13］。据报道，2005年海滨雀稗杂交品种“Sea Spray”已正式引入我国，但尚未见其在江浙海涂推广应用，推测可能与生态适应性和抗寒性有关。近年来，江苏省农业科学院钟小仙等［14］一直致力于可自交结实型海滨雀稗新品种选育，以幼穗离体培养获得的胚性愈伤组织为材料，从经一定浓度和时间的秋水仙素诱导处理获得的再生植株上，收获到了体细胞突变体M1种子，M1种子均能正常发芽成苗。本研究通过比较能自交结实的海滨雀稗突变体SP2008－3和对照品种Adalayd的植物学特征和叶片气孔特性，结合细胞遗传学鉴定和DNA分子检测，探索海滨雀稗突变体SP2008－3的特异性，为育成具有完全自主知识产权、可种子繁殖的海滨雀稗新品种提供基础保证［15］，为大面积盐渍土利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

海滨雀稗品种Adalayd，2n＝20，为自交不亲和二倍体，20世纪末从美国夏威夷引进我国，2006年江苏省农业科学院从杭州白云草业研究所有限公司引进；海滨雀稗突变体SP2008－3，以Adalayd幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织为材料［16］，经秋水仙素诱导获得了再生植株，2009年，经田间结实性鉴定，获得了可自交结实的再生植株并收获到种子，2010年4月播种出苗后植株成坪。

1.2 试验方法

1.2.1 植物学特征的观测 每种材料分别选取20个匍匐茎，测量从顶端向后第4个节的节间长度及直径；选取20个直立茎，测量中间1个节的节间长度及直径；选取30片新出的第3片完全展开叶，测量叶片长度和宽度。

1.2.2 叶片气孔特性的观测 分别选取2种供试材料新出的第3片完全展开叶中间部位长1 cm、宽为叶片自然宽度的部分叶片，采用离析法［17］，浸泡在等量的30%过氧化氢－醋酸溶液中，在60℃烘箱内放置24 h，待叶肉组织和表皮细胞分离后，把离析材料取出，放入装有适量蒸馏水的培养皿中，用镊子分离叶片上、下表皮，1%番红染色1～2 min，制成临时装片，在OLYMPUS CX31光学显微镜下观察和拍照。

采用形态学图像分析系统（JD801，江苏捷达软件工程有限公司，南京）测定气孔的密度、宽度和长度。每种供试材料选择30个视野拍照，统计气孔器数目，计算其密度。每种供试材料拍摄15个视野，统计气孔器长度和宽度。气孔器长度是指气孔关闭状态下哑铃形气孔器的长度；气孔器宽度是气孔关闭状态下垂直于哑铃形气孔器的最宽值［18］。

1.2.3 细胞学鉴定 分别取海滨雀稗SP2008－3和Adalayd茎节，将其放入1／2 Hoagland营养液中培养生根，待根长至1～2 cm时，于上午9：00前后取出切下根尖，经自来水冲洗后加入到装有预处理液8－羟基喹啉的离心管中，置于4℃冰箱中处理2～4 h。材料预处理后用自来水冲洗30 min后用卡诺氏固定液于冰箱中固定24 h，固定后的材料用蒸馏水冲洗后放入装有预热的1 mol／L盐酸的离心管中于60℃恒温水浴中解离4～6 min，解离后的材料用蒸馏水冲洗30 min后，置于卡宝品红中染色30 min。染色后滴1滴45%冰醋酸于载玻片压片观察，在显微镜下镜检。在实际操作中，不同学者所统计细胞的数目有很大差别，一般认为85%以上的细胞具有相同染色体数时，方能确定该植物染色体数［19，20］。本试验选择25个染色体分散良好、形态清晰的中期分裂相细胞进行观察、拍照和统计染色体数目。

1.2.4 RAPD分子鉴定 取海滨雀稗体细胞突变体SP2008－3、原始对照Adalayd（CK1）及其幼穗离体培养再生植株（CK2）的幼嫩叶片，采用Karroten公司生产的植物DNA提取试剂盒（Karroten TM Plant Genomic DNA Extraction kit）提取DNA。选取RAPD随机引物34条委托上海生工生物工程有限公司合成。扩增反应在Ta KaRa公司PCR Thermal Cycler D上进行，反应体积25μL，内含10×Buffer（含 Mg2＋），10μmol／L d NTP，Taq DNA聚合酶0.3μL，引物0.5μmol／L，总DNA模板1μL。PCR反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共45个循环，最后再72℃ 延伸7 min，4℃ 保存。扩增产物用1.4%的琼脂糖凝胶电泳分离，talon全自动凝胶成像分析系统观察并记录结果。对表现多态性的引物，重复3次，选择重复性好的引物进行分析。

随机选用34个合成引物对海滨雀稗突变体SP2008－3、对照Adalayd（CK1）和Adalayd幼穗离体培养再生植株（CK2）进行了RAPD－PCR反应体系扩增，筛选出2个多态性和重复性好的引物S369和S131。S369序列为5′CCCTACCGAC3′；S131序列为5′TTGGTACCCC3′。

1.3 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 植物学特征的比较

与Adalayd相比，SP2008－3匍匐茎节间长度及匍匐茎直径分别减小34.77%和11.76%，差异显著（P＜0.05）；叶片长度及宽度分别显著增加22.55%和11.11%；直立茎缩短变粗，但与Adalayd无显著差异（P＞0.05）（表1）。

2.2 细胞学鉴定

在统计的25个染色体分散良好、形态清晰的中期分裂相细胞中，SP2008－3中有22个细胞的染色体数目为20条，占所统计细胞总数的88%，比例超过了85%，据此确定海滨雀稗SP2008－3的体细胞染色体数目为2n＝20（图1）。

表1 SP2008－3与Adalayd植物学特征比较Table 1 Comparison on phytological characteristics between SP2008－3 and Adalayd

图1 海滨雀稗突变体2008－3（A）与Adalayd（B）有丝分裂中期染色体Fig.1 Chromosome of mutant SP2008－3（A）and Adalayd（B）at mitotic metaphase

2.3 RAPD分子鉴定

引物S369序列为5′CCCTACCGAC3′，与Adalayd（CK1、CK2）相比，SP2008－3缺少1条约3 000 bp的条带和1条约800 bp的条带；引物S131序列为5′TTGGTACCCC3′，与 Adalayd（CK1、CK2）相比，SP2008－3植株缺少1条约200 bp的条带（DNA Marker 5 000 bp）。再用重复性较好的引物S369对所有3个材料进行PCR扩增，不仅条带清晰，而且经3次重复表现稳定。RAPD分析结果显示，对照材料海滨雀稗Adalayd（CK1、CK2）均含有约1 100 bp的条带，而SP2008－3则缺失（图2）。

2.4 叶片表皮气孔特性的比较

与Adalayd相比，海滨雀稗体细胞突变体SP2008－3叶片上表皮气孔密度增加20.58%，气孔器长度减小9.64%，气孔器宽度减小6.31%，差异均达显著水平。海滨雀稗体细胞突变体SP2008－3叶片下表皮气孔器密度比Adalayd增加40.62%，气孔器长度和气孔器宽度分别比Adalayd减小6.73%和5.33%，且均呈显著性差异（表2）。

3 讨论

形态学鉴定是比较传统、常规的品种鉴定技术［21］。刘建秀等［22］根据狗牙根匍匐茎节间长和节间直径、叶长和叶宽等19个外部性状对华东地区34个点上的88份狗牙根材料进行了遗传多样性的研究，结果表明，华东地区狗牙根可分为5个类型，即矮细型、矮粗型、斜细型、斜粗型和直立型。金洪等［23］通过对结缕草（Zoysiajaponica）叶宽、匍匐茎中部节间长、匍匐茎的直径、穗长等表型性状研究了结缕草居群内部的变异类型，将20个居群分为8类。本研究通过对海滨雀稗体细胞突变体SP2008－3和Adalayd植物学特性比较发现，SP2008－3除了可自交结实的显著特性外，匍匐茎节间长度、匍匐茎茎粗均较Adalayd显著减小；叶片长度和宽度均显著增加。这表明，经秋水仙素诱导后的SP2008－3在表型性状上与对照材料Adalayd存在显著差异。

叶片是进行光合作用、呼吸作用、蒸腾作用等生理代谢的主要器官，叶解剖结构与植物生长相关性密切，因此，叶解剖结构可作为良种筛选的又一辅助指标［24，25］。气孔在调控水分丢失和光合作用之间总是处于一种折中状态［26］，气孔器密度的增加有利于提高净光合速率和品种耐湿能力，气孔器减小则有利于减小叶片蒸腾速率［25，27，28］。与对照品种Adalayd相比，海滨雀稗突变体SP2008－3叶片上、下表皮气孔器密度显著增加，气孔器长度，气孔器宽度均显著减小。气孔器特性改变与生理代谢的相关性正在进一步研究。

图2 突变体SP2008－3 RAPD多态性分析Fig.2 RAPD analyses of mutant SP2008－3

表2 SP2008－3与Adalayd气孔器特性的比较Table 2 Comparison of stomata characteristic between SP2008－3 and Adalayd

在植物诱变育种过程中，秋水仙素作为一种常用的药剂，因作用时期不同，诱变机理和结果不同，适宜浓度的秋水仙素能破坏纺锤丝的形成，使分生细胞复制的染色体在细胞分裂时不能分向两极，从而导致新生细胞的染色体加倍［29］；而秋水仙素的作用时期为DNA复制期，其通过植物细胞在复制转录过程中渗入细胞内，发生碱基的替代或嵌入碱基之间，造成染色体变异，进而发生复制或转录错误，从而导致基因突变［30］。对海滨雀稗SP2008－3体细胞染色体初步计数结果表明，海滨雀稗突变体SP2008－3的体细胞染色体数目与对照品种Adalayd相同，为2n＝20，但是其染色体大小、随体着丝点位置等是否不同于Adalayd，又或者其在细胞水平上未发生改变［31，32］，尚有待于进一步研究。

随着生物实验技术的迅速发展，植物品种鉴定的方法已从简单、粗放的形态学鉴定进入到了分子生物学鉴定水平。常见的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR等［33］。其中RAPD具有操作简便快速，对DNA的纯度要求不高，DNA用量少，检测位点多，灵敏度高等优点［31，33］。解新明等［34］利用RAPD技术将来自广东省海滨雀稗的3个野生居群和1个草坪型栽培品种分为两类。本研究中海滨雀稗SP2008－3与对照Adalayd相比，缺失了1条约1 100 bp的条带，进一步表明在DNA水平上海滨雀稗SP2008－3发生了变异。这一结果与Martelotto等［35］对2个海滨雀稗种的同源多倍体RAPD检测结果相似，基因重组造成条带缺失的频率显著高于获得新条带的概率。

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