环介导等温扩增技术在疾控机构微生物检测中的应用

唐海丰，熊鹿言，李 勇

（上海市普陀区疾病预防控制中心，上海 200333）

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由日本研究人员Notomi等发明的一种新型的体外核酸扩增技术[1]。该技术利用两对特殊引物和有链置换活性的Bst（Bacillus stearothermophilus）DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。一般情况下，LAMP可以在60 min内扩增出109～1010倍靶序列拷贝，得到浓度高达500µg/ml的DNA。其扩增产物既可以通过常规的荧光定量和电泳检测，也可以通过简易的目测比色和焦磷酸镁浊度检测，还可以添加SYBR Green I、溴化乙锭（EB）或其他核酸染色剂进行显色后观察[2]。若在反应体系中加入逆转录酶，LAMP还可以实现对RNA模板的扩增（RT-LAMP）[3]。

LAMP技术由于其特异性强，敏感性高，操作简便，产物易检测，不需昂贵设备和特殊试剂就能特异、高效、快速、简便地扩增靶序列等优点，自问世后短短几年已在各领域得到广泛应用，目前国外已有较多的此类报道，并建立了专门的官方网站（http：//loopamp.eiken.co.jp/lamp/index.html）。LAMP在国内的应用虽然起步较晚，但专家学者已在畜牧业、植物检疫、食品安全、医学检验和传染性疾病检测等方面做了诸多研究，并不断对LAMP技术进行改良使其更好地发挥作用[4-9]。本文就LAMP在疾病预防控制机构病原微生物检测方面的应用作简单综述。

1 LAMP技术在疾病预防控制机构病原微生物检测方面的应用

1.1 LAMP技术在呼吸道病毒检测方面的应用 甲型H1N1流感的爆发对人类健康造成严重威胁，为更好地进行传染病防控，减少不必要的忧虑和社会恐慌，快速特异的检测出病原体至关重要。付文亮等[10]用RT-LAMP检测甲型H1N1流感病毒核酸，并比较电泳、直接观察、加入SYBR Green I核酸染料和优化后的预染核酸染料的检测灵敏度，结果显示电泳检测的灵敏度最高，加入SYBR Green I染料的灵敏度略低，而直接肉眼观察灵敏度低约2个数量级。加入优化后的预染染料其检测灵敏度与加入SYBR Green I核酸染料相当。徐灵艳等[11]基于定性检测甲型H1N1流感病毒的LAMP技术，研究出一种新系统，利用LAMP检测过程中产生的副产物焦磷酸镁沉淀导致检测样品池的浊度变化，而定性确定H1N1病毒分子是否存在。姜晓慧等[12]对H3亚型流感病毒设计两对特征性引物和一个环引物，采用RT-LAMP技术检测H3亚型流感病毒核酸，敏感度可达0.01TCID50/反应，与荧光定量RT-PCR的敏感度相一致，且对H1和H5亚型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒与腺病毒无交叉反应，具有良好的特异性。采用该方法检测58份临床标本，病毒分离的阳性率为37.9%，而荧光定量RT-PCR与RT-LAMP的阳性率分别为53.45%和51.72%，敏感度明显高于通常的细胞病毒分离。李启明等[13]建立了检测H5N1禽流感病毒基因的RT-LAMP方法。使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物，在等温条件下进行核酸扩增反应，对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测，并以SYBR Green I为反应指示剂进行了RT-LAMP，对该反应进行实时监控，经对扩增产物做内切酶验证和测序分析，证明了RT-LAMP技术的特异性；同时，用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示，利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的血凝素（HA）、NA基因区，且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子的水平。张坤等[14]针对H5N1禽流感病毒HA基因序列保守区域设计LAMP外引物、内引物和环引物，以克隆的阳性质粒为模板，对试验中的几个重要参数进行优化。结果LAMP检测方法对H5N1禽流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝，其引物对于H1、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特异性扩增，表现出良好的H5亚型特异性。侯佳蕾等[15]根据美国国家生物信息中心（GenBank）上登录的H5亚型禽流感病毒（H5-AIV）血凝素基因序列，设计了一套特异识别HA基因序列中6个不同区段的LAMP引物，并以此套引物建立了一种基于LAMP技术的H5亚型禽流感病毒诊断方法。实验结果表明，该方法对H5-AIV RNA的最小检测限为10-6，灵敏性高于一步RT-PCR方法，全部反应在1.5 h内完成；在反应体系中添加SYBR Green I染料后，可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试验证明，该方法灵敏度高，特异性好，能够作为H5亚型禽流感病毒的快速诊断方法。彭宜等[16]针对H9亚型禽流感病毒AIV的HA基因序列，在保守区域设计了一套针对HA基因8个区域的6条特征性引物，并对反应条件进行优化，建立了适用于H9亚型禽流感病毒AIV的RT-LAMP方法。结果表明，该方法对H3、H5、H7亚型AIV及其他禽呼吸道病原体均无扩增反应，并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察，且扩增反应只需在常规水浴锅中进行，50 min之内即可完成反应。该方法对H9亚型AIV RNA的最小检测限为0.01 pg，灵敏度是一步法RT-PCR方法的1 000倍。蒋菲等[17]利用相似技术对H9亚型禽流感病毒AIVHA进行了RT-LAMP方法的建立，最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段，较RT-PCR方法敏感10倍。通过对15种H亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒的检测表明，该方法具有很好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与Mn2+的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定，并且其判断结果与浊度判断结果一致。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测，RT-LAMP与RT-PCR检出阳性样本数分别为61份和46份，表明RT-LAMP方法的阳性检出率高于RT-PCR。

1.2 LAMP技术在呼吸道细菌检测方面的应用 嗜肺军团菌于1976年首次在美国被发现，是一种革兰氏阴性条件致病菌，主要通过污染建筑物中的水系传播，易大规模暴发和流行。随着经济发展、中央空调的普遍使用，军团菌爆发的危险性日益增加。由于军团菌生长缓慢，普通培养检测周期较长，血清免疫学方法灵敏度和特异性不高，因此其检测存在一定的局限性。王水荣等[18]应用LAMP针对嗜肺军团菌mip基因设计5条引物（2条内引物、2条外引物及1条环引物）对LAMP反应条件和反应体系进行优化，并将该方法的特异性和敏感性与传统培养分离方法及定量PCR方法比较。实验结果表明，LAMP方法的检出率高于传统培养分离方法及定量PCR，实验建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测嗜肺军团菌。吕沁风等[19]运用LAMP设计一套引物特异性识别嗜肺军团菌mip基因的6个特殊区域，在恒温条件下，对8株嗜肺军团菌和5株其他细菌进行检测，并与普通PCR方法进行比对，验证该方法的特异性和灵敏度。结果所有嗜肺军团菌扩增产物均产生肉眼可见的白色沉淀，而其他不同菌株均不产生沉淀；加入荧光染料Smart green后，嗜肺军团菌扩增产物均产生强绿荧光，其他菌株呈弱荧光。与普通PCR（检出限约为57.6 pg）比，LAMP扩增反应的灵敏度大100倍左右，基因组DNA检出限为576 fg，阳性水样检出限为8 CFU/ml。脑膜炎奈瑟菌（Nm）是流行性脑脊髓膜炎（流脑）的病原菌，人类是脑膜炎奈瑟菌唯一的易感宿主。李海清等[20]针对脑膜炎奈瑟菌属（ctrA）基因序列的6个区域设计4条LAMP引物（2条内引物和2条外引物），同时设计2条环引物，并对反应条件进行优化。分别验证该方法的特异性及敏感性，并与普通PCR进行比较。实验结果表明，在适宜反应条件所设计引物对脑膜炎奈瑟菌的扩增的特异性及敏感性均较好，与普通PCR方法比较，LAMP敏感性比普通PCR高10倍。周义正等[21]针对肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）R6株的lytA基因序列设计特异LAMP引物，以盐酸胍-苯甲醇法提取阳性血培养瓶中细菌DNA，以LAMP技术扩增lytA基因，反应条件为63℃45 min，采用肉眼观察浊度和琼脂糖电泳的方法来观察结果。结果在196份阳性血培养瓶中，采用LAMP法检测到肺炎链球菌16株，与传统的方法比较，其检测肺炎链球菌的灵敏度和特异度均达到100%，模拟标本的检测结果显示该方法的最低检测限为102CFU/ml。结核分枝杆菌的培养周期较长，不利于结核分枝杆菌的快速检测。易海华等[22]根据结核分枝杆菌gyrB特征性序列设计的3对特征性引物对痰液中和培养基中的结核分枝杆菌进行检测。其中1对环状引物结合于特征性序列中环状结构部分，可极大地加快LAMP反应速度，且不干扰内引物在LAMP反应中作用。实验结果表明，使用环状引物的LAMP反应可在0.5 h内完成，总共分析时间不超过1 h。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右，具有与实时PCR（Real-time PCR）技术相同的特异度。

1.3 LAMP技术在食源性致病菌检测方面的应用 食品安全是近年社会关注的一个焦点。食源性疾病与食品污染构成了一个巨大并不断扩大的公共卫生问题。自2002年起，我国建立了国家食源性病原菌监测网络，为食品安全和风险评估提供科学依据。在食品污染所引发的肠道疾病中，不耐热型产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli）是引起食物中毒的常见肠道致病菌之一。罗海等[23]选用不耐热肠毒素（LT）编码基因的6个保守区设计LAMP引物，优化dNTPs浓度、Bst DNA聚合酶浓度、反应温度、反应时间等反应条件，评估该方法的特异性和灵敏性。结果显示，该方法检测不耐热型产肠毒素大肠杆菌时间短，特异性较好，灵敏度高。沙门菌属是引起细菌性食物中毒的重要病原体之一，也是肠杆菌科中最复杂的菌属。2003-2005年食源性疾病监测网的数据显示沙门菌占微生物食源性疾病的17.19%，排在第2位[24]。欧新华等[25]针对沙门菌属侵袭蛋白（invA）基因序列的6个区域设计4条LAMP引物，65℃保温约60 min完成对沙门菌属的扩增。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌（对照组）来验证该方法的特异性，将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测，比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带，9株非沙门菌未出现LAMP扩增，产物的特异性通过限制性内切酶得到证实。LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同，但其敏感性比普通PCR高10倍，LAMP检测沙门菌属的检测下限为10 CFU/ml，PCR检测下限为100 CFU/ml。LAMP检测速度相比PCR更快速，在60 min内即可完成扩增反应。朱胜梅等[26]根据沙门菌特异性invA基因设计引物进行LAMP，同时优化反应条件，建立了沙门菌LAMP快速检测技术。实验结果表明，LAMP的最佳反应条件为外引物浓度5 pmol/L、内引物浓度为40 pmol/L，Mg2+浓度为6 mmol/L，dNTP浓度为0.8 mmol/L，甜菜碱浓度0.8 mmol/L，Bst DNA聚合酶8 U，反应温度63℃，反应时间1 h，在此条件下LAMP检测到沙门菌DNA的敏感度达10 fg时反应，且与其他常见的细菌无交叉反应，对牛奶样品的检出量为102CFU/ml。易海华等[27]针对志贺菌侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）特征性保守序列设计1套4条引物，应用LAMP技术对21株志贺菌和非志贺菌进行特异性检测以确定其特异性；使用LAMP和聚合酶链式反应对ipaH基因重组质粒倍比稀释液进行检测以确定其灵敏度；使用重组质粒计算其初始拷贝数与反应时间之间的线性关系以评估定量检测的可能性。实验结果表明，LAMP技术可以在1 h内获得结果；有较好的特异性，与其他17种食源性致病菌无交叉反应；LAMP检测技术的灵敏度高出经典PCR技术10倍以上，检测限达到200拷贝/µl，平均变异系数＜5%；反应时间与模板初始浓度有良好的线性关系（r2=0.9855）。徐芊等[28]针对副溶血性弧菌不耐热溶血素基因（tdh）设计4条特异性引物（两条内引物和两条外引物）进行LAMP扩增，对扩增反应进行优化，最佳反应时间为60 min，反应温度为60℃。对12种细菌共28株菌进行LAMP扩增，仅副溶血性弧菌得到阳性扩增结果，证明引物具有很高的特异性。副溶血性弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别为90 fg和24 CFU/ml。对模拟食品样品进行检测，检测限为89 CFU/g，整个实验过程1 h即可完成。易海华等[29]针对金黄色葡萄球菌clfA基因保守序列，根据LAMP方法的原理，设计LAMP反应体系和程序，对方法的特异性、灵敏度、重复性及初始拷贝数的对数值与反应时间（荧光信号值为1×104时对应的时间）之间的线性关系进行评估。结果使用LAMP方法可以在0.5 h内获得检测结果，LAMP检测技术的灵敏度高出经典PCR技术10倍以上，与其他相关致病菌无交叉反应，平均试验间变异系数小于5%，反应时间与模板浓度有良好的线性关系（r2=0.9501），LAMP法检测临床样本中金黄葡萄球菌的灵敏度为100%，特异度为94.4%，符合性为96.6%。申建维等[30]利用包被有SPA单克隆抗体的磁珠富集样品中的金黄色葡萄球菌，快速提取其DNA，用LAMP扩增金黄色葡萄球菌耐药基因mecA,扩增条件为65℃保温1 h。在反应过程中，荧光探针与mecA基因的扩增产物互补序列结合，产生荧光，通过检测反应管中的荧光值来判定结果。实验结果显示，该方法的最低检测限为10 CFU/ml，与M-H培养基苯唑西林药敏试验结果相比较，灵敏性为99%，特异性为90.9%；与PCR方法比较，敏感性为100%，特异性为100%；实验时间缩短1 h。齐哲等[31]针对蜡样芽胞杆菌的溶血素基因hblA设计引物，将FTA滤膜提取DNA与LAMP法相结合，检测蜡样芽胞杆菌和人工污染蜡样芽胞杆菌的消毒乳。结果表明，LAMP对抽提的DNA最低检出浓度为4.4 CFU/ml，比PCR检测灵敏度高10倍。人工污染消毒乳中蜡样芽胞杆菌的检出限为57 CFU/ml。LAMP扩增最短可在20 min内完成，对消毒乳中蜡样芽胞杆菌的整个检测（包括DNA提取、LAMP和电泳）可在2 h内完成。空肠弯曲菌是世界上公认的引起急性腹泻和肠胃炎的主要病原菌。林超等[32]以空肠弯曲菌的促旋酶基因A（gyrA）设计引物建立空肠弯曲菌的LAMP快速检测方法。实验结果表明，设计的引物具有良好的特异性，与细菌平板计数和PCR法的灵敏度比较，LAMP检测与PCR法有相近的灵敏度，比细菌平板计数法灵敏度高3个数量级。研究结果还表明，提取核酸前加入DNase可以有效地减少死菌DNA对LAMP结果的影响。单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一种能够引起人兽共患疾病的食源性致病菌，WHO已将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一，主要能引起人与动物的脑炎、菌血症、流产、无败血症性单核细胞增多症等，尤其是免疫力低下者、婴幼儿、老年人、孕妇等易受感染而发病。唐梦君等[33]根据LM hlyA基因序列中的保守区域进行LAMP扩增，并与常规PCR方法进行比较，结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带，LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102CFU/ml，而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104CFU/ml，对10株细菌进行LAMP扩增，仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果，从DNA提取到报告结果耗时仅1 h。张体银等[34]同样针对单增李斯特菌hly基因保守区域设计特异引物进行DNA等温扩增。3株单增李斯特菌均扩增出特异性目的片段，而10株非单增李斯特菌均未产生目的片段，特异性为100%，无假阳性和假阴性出现。用LAMP在65℃条件下1 h内即可检出单增李斯特菌，灵敏度达100 CFU/ml。用该方法与国标方法分别检测50种样品中的单增李斯特菌，两种方法的符合率达到100%。鲁曦等[35]针对阪崎肠杆菌16s RNA基因设计4条引物特异性识别靶基因的六个特殊区域，建立了一套婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌快速检测的LAMP方法。该方法能够在5 h内检测出复原乳样品中101 CFU/ml的阪崎肠杆菌，检测阪崎肠杆菌基因组DNA的灵敏度为100 fg，不仅能够用于婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌的检测，而且满足了对婴幼儿乳粉中阪崎肠杆菌快速检测的迫切需要。朱水荣等[36]针对EHEC O157：H7的O157抗原编码rfbE、志贺样毒素stx2、H7鞭毛抗原编码fliC基因分别设计引物，并对LAMP反应条件和反应体系进行优化。对2株背景明确的实验对照菌EHEC O157：H7标准菌株、17株O157地方分离株、33株非O157其他肠道菌株进行检测，并与PCR结果比较，验证该方法的特异性、敏感性。结果显示具有相应靶基因的O157菌株经LAMP的检测结果均与PCR法相同，呈绿色且电泳有相应条带为阳性，非O157其他肠道菌株均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性。反应体系检测限为26 CFU/ml，且结果在白光下通过肉眼即可判断。朱海等[37]选取E.coli O157：H7的rfbE基因设计LAMP引物，优化建立LAMP检测体系。并用该体系和国标法对76份人工污染样品进行检测。结果所建立的E.coli O157：H7 LAMP体系具有良好的特异性，用该体系对9属13种41株菌进行检测，结果只有E.coli O157：H7的扩增产物电泳结果为阶梯状条带，非E.coli O157：H7均未产生扩增引物，灵敏性为27 CFU/ml。样品及培养基对反应体系无影响或影响很小。对76份样品进行了检测，E.coli O157：H7 LAMP检测方法与国标法的总符合率为96.1%，2 h内即可完成检测。徐义刚等[38]基于EHEC O157：H7保守的rfbE基因序列，设计4条引物，成功建立了EHEC O157：H7 LAMP快速检测方法，60 min内即可完成致病菌检测。利用该方法对30种共38株细菌进行检测，所试EHEC O157：H7均为阳性结果，说明该方法具有高度的特异性。该方法对纯培养的EHEC O157：H7检出限为12 CFU/ml，污染食品中EHEC O157：H7的检出限为18 CFU/g。实践应用表明，对1 121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品进行检测，检出57份LAMP阳性，与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。霍乱是由霍乱弧菌引起的，以腹泻为主要症状的烈性传染病，在我国属于甲类传染病。朱水荣等[39]应用LAMP针对O139霍乱弧菌wbfR基因设计4条引物（2条内引物和2条外引物），优化LAMP反应条件和反应体系，并对13株种系背景明确的霍乱弧菌不同实验对照株、30株O139群霍乱弧菌地方分离株、10株O1群霍乱弧菌地方分离株、32株其他肠道菌进行检测，验证该方法的特异性，通过肉眼目测或电泳检测比较结果。结果所有O139群霍乱弧菌经LAMP检测均呈绿色电泳有阶梯状条带为阳性，O1群霍乱弧菌及其他肠道菌均检测呈橙色并电泳无相应条带为阴性；该体系最低检测限为63 CFU/ml。该研究建立的LAMP方法能够快速、灵敏、特异地检测O139群霍乱弧菌，无需昂贵的仪器，简单方便，非常适合基层检验部门或小型实验室以及流行病学人员于应急车上或现场监测等使用，值得推广。嗜水气单胞菌普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌株对水产动物、家畜和人均有致病作用，在动物疾病学和食品卫生学研究上都具有重要意义。程天印等[40]基于嗜水气单胞菌气溶素基因的序列，设计了一套引物，通过条件优化，成功建立了针对致病性嗜水气单胞菌的LAMP检测法。结果表明该法只检出致病性嗜水气单胞菌，对不同浓度的细菌悬液扩增结果表明LAMP检测嗜水气单胞菌的最低菌液浓度为1.4～14 CFU/μl，高于普通PCR方法。

1.4 LAMP技术在肠道病毒检测方面的应用 诺如病毒是继轮状病毒后引起非细菌性急性肠胃炎的主要病原之一，常通过粪口途径传播。陈宗峰等[41]采用RT-LAMP扩增诺如病毒特异性基因，并与RT-PCR方法比较。结果RT-LAMP法更加简便快速、特异性好、具有更高的灵敏度、不需要复杂仪器设备等优点，为临床检测诺如病毒快速简便的新方法。手足口病（Hand foot and mouth disease，HFMD）自1957年首次报告以来，世界各地不断出现新疫情，其流行呈明显上升趋势。HFMD可由多种病毒引起，其中肠道病毒71型（EV71）是导致HFMD最重要的病原体。耿英芝等[42]针对EV71 VP1基因的8个区域设计6条特异性引物，建立检测该靶序列的RT-LAMP方法，对其特异性和敏感性进行了验证，并对手足口病患者标本进行检测，并与RT-PCR及Real-time PCR方法进行了比较。实验结果表明，利用RT-LAMP方法能成功检测到EV71 VP1基因区，等温条件下60 min内即可完成检测，该方法简便快捷、敏感性高、特异性好，其阳性率高于RT-PCR方法（P＜0.05），与Real-time PCR结果呈现良好的一致性（P＞0.05），适用于EV71感染的快速检测及分子流行病学的监测，具有很好的开发应用前景。

1.5 LAMP技术在寄生虫检测方面的应用 弓形虫是一种严重危害人类及家畜的机会性致病原虫，呈世界级分布，可侵犯除成熟红细胞以外的任何有核细胞，引起多种组织、器官病变和损害。李月梅等[43]研究建立了弓形虫快速检测的LAMP方法。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试，此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平，扩增产物内切酶验证结果正确；成功检测到弓形虫基因区，对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性，显示出较强的特异性。杨秋林等[44]用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组DNA，设计两对扩增弓形虫B1基因的LAMP引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞做对照进行LAMP反应，产物经SYBR GreenⅠ显色及电泳后观察结果，将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml等8个浓度进行LAMP反应验证该方法的敏感性。实验结果显示，弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色为阳性，LAMP产物经电泳后呈特征性梯状条带，对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。尾蚴是日本血吸虫的感染期，检测水体尾蚴的有无，可为安全用水、预防人畜感染提供依据，现用的尾蚴检测方法操作较繁琐。杨秋林等[45]使用基因释放剂快速提取尾蚴基因组DNA，设计4条扩增尾蚴钙结合蛋白基因的LAMP，以华支睾吸虫为阴性对照进行LAMP反应，产物经显色、电泳鉴定。用细吸管在解剖镜下分别吸取20条、10条、5条、1条尾蚴进行LAMP反应检测其敏感性。结果尾蚴检测管经显色后呈绿色（阳性），对照组呈棕色（阴性），产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带，对照组无扩增产物，LAMP可检测到尾蚴的最低数量为1条。间日疟原虫（Plasmodium vivax，P.V）是间日疟的病原体。疟疾的传统检查方法是血膜涂片经染色后镜检，该法简便、成本低，但费时、费力且容易漏诊。杨秋林等[46]用酚-氯仿法提取P.V基因组DNA，设计4条扩增P.V环子孢子蛋白基因的LAMP引物，以恶性疟原虫、弓形虫、人全血DNA为对照进行LAMP反应，产物经显色、电泳鉴定。将P.V血样用健康人血做1.5×10-3～1.5×10-86个浓度后进行LAMP检测其敏感性。结果P.V LAMP扩增产物检测管显色后呈阳性，对照组均为阴性。产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带，对照组均无扩增条带。LAMP检测P.V的敏感度为1.5个疟原虫/107RBC。卡氏肺孢子虫（Pneumocystis carinii，Pc）寄生于哺乳动物肺部，引起卡氏肺孢子虫肺炎（PCP），由于PCP的病原学检查困难，健康人群抗体阳性率高达50%～60%，故检测抗体也不适于PCP的诊断。杨秋林等[47]用醋酸可的松经皮下注射Wistar大鼠诱导Pc基因，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）提取Pc基因组DNA。设计4条扩增Pc线粒体核糖体大亚基（mtrRNA）基因的LAMP引物，以结核杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、弓形虫、大鼠白细胞为对照，进行LAMP反应。LAMP产物经显色、电泳及酶切鉴定。将Pc DNA稀释10倍后同时进行LAMP和PCR，比较其敏感性。结果Pc检测管经显色后呈绿色（阳性），对照组均呈棕色（阴性）。Pc LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带，扩增产物经Tail限制性内切酶酶切鉴定正确，对照组均无扩增产物。LAMP可检测到虫体DNA的最低浓度是1 pg/µl，为PCR的10倍。

2 结 语

LAMP方法是本世纪发展起来的一种分子生物学技术，虽然还存在着诸多的缺点和不足，但其在多个领域表现出来的特异性高、敏感性好、便捷快速等优点使其在疾病预防控制机构微生物检测方面的应用显示出了令人鼓舞的前景。该方法不需昂贵的PCR仪和特殊检测试剂，尤其适合在基层检测机构微生物实验室的推广和应用。

LAMP技术虽然原理复杂，特别是引物的设计相当专业，其难点主要在于如何从200～300个碱基的靶序列中设计4条符合要求的引物。但这些都可以由专业的研究单位和试剂公司来完成，对检测人员而言其操作却是十分方便。若开发研究相应的检测试剂盒，必然会有巨大的市场前景，该技术也有望成为简易的常规检测手段。

随着LAMP技术的不断研究和改进，其在微生物检测领域将发挥更加重要的作用。坚信随着技术的不断完善，该方法作为分子生物学的一种快速检测技术必将广泛应用于各种病原体的快速检测和疾病的快速诊断，为及时控制传染病疫情和应对公共卫生突发事件提供强有力的技术支撑。

[1]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].NucleicAcids Res,2000,28(12)：63.

[2]Yasuyoshi M,Nagamine K,Tmita N,et al.Tection of Loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].Bioch and Bioph Res Com,2001,289：150-154.

[3]Soliman H,El-Matbouli M.Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus(VHS)[J].Vet Microbiol,2006,114(3-4)：205-213.

[4]彭永刚,孙恩成,刘 飞,等.环介导等温扩增技术在畜牧兽医领域的应用[J].中国兽医科学,2010,40（5）：543-546.

[5]杨雷亮,邱德义,管 维,等.核酸环介导等温扩增技术及其在植物检疫中的作用[J].植物检疫,2009,23（4）：42-44.

[6]江迎鸿,刘 垚,谭贵良,等.LAMP技术及其在食品安全检测中的应用[J].广东农业科学,2010,7：220-222.

[7]申振华,陈文明,李爱华,等.LAMP技术在医学检验中的应用[J].医学检验与临床,2010,21（4）：97-98.

[8]蔡哲钧,冯杰雄.环介导等温扩增技术及在传染性疾病检测中的应用[J].国际流行病学传染病学杂志,2006,33（5）：343-358.

[9]刘宝山,潘树德,陈 博,等.环介导等温扩增技术的改进和发展[J].畜牧与兽医,2009,41（7）：98-101.

[10]付文亮,蔡 欣,查 磊,等.RT-LAMP检测甲型H1N1病毒核酸几种结果判定方法[J].医学研究杂志,2010,39（5）：68-70.

[11]徐灵艳,李富勇,吴青青,等.基于核酸环介导等温扩增的甲型H1N1流感检测系统设计[C].中国仪器仪表学会,2010年全国科学仪器自主创新及应用技术研讨会论文,武汉,2010.

[12]姜晓慧,陈 寅,卢亦愚,等.甲3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用[J].中国疫苗和免疫,2008,14（3）：242-245.

[13]李启明,马学军,高寒春,等.逆转录环介导等温核酸扩增技术（RT-LAMP）在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用[J].病毒学报,2008,24（3）：178-184.

[14]张 坤,黄 伟,李 刚.H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立[J].生物技术通讯,2009,20（2）：217-220.

[15]侯佳蕾,罗开健,樊惠英,等.H5亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立[J].中国兽医科学,2008,38（12）：1070-1074.

[16]彭 宜,谢芝勋,刘加波,等.H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报,2011,27（1）：19-28.

[17]蒋 菲,黄书林,徐 威,等.H9亚型禽流感病毒环介导等温扩增检测方法的建立与荧光指示剂的应用[J].农业生物技术学报,2011,19（1）：191-196.

[18]王水荣,王志刚,张 政,等.嗜肺军团菌环介导等温扩增快速检测方法的建立与应用[J].中华流行病学杂志,2009,30（5）：481-485.

[19]吕沁风,郑 伟,罗 鹏,等.嗜肺军团菌环介导等温扩增检测法的建立[J].浙江大学学报（医学版）,2010,39（3）：305-310.

[20]李海清,邵祝军,朱兵清,等.环介导等温扩增技术快速检测脑膜炎奈瑟菌属方法的建立[J].疾病监测,2010,25（5）：397-400.

[21]周义正,陈 丽,李红海,等.环介导等温扩增检测肺炎链球菌方法的建立及临床应用[J].中华检验医学杂志,2008,31（5）：562-565.

[22]易海华,丁永健,钱志娟,等.环介导等温扩增技术检测痰标本中结核分支杆菌的研究[J].中国国境卫生检疫杂志,2008,31（1）：7-17.

[23]罗 海,郑春亮,万红梅,等.环介导等温扩增法快速检测产肠毒素大肠杆菌的研究[J].食品研究与开发,2010,31（7）：127-130.

[24]樊永祥.食源性疾病控制与餐饮食品安全管理[J].国外医学（卫生学分册）,2006,33（3）：170-175.

[25]欧新华,张如胜,宋克云,等.环介导等温扩增（LAMP）技术检测沙门菌属方法的建立[J].实用预防医学,2008,15（6）：1945-1947.

[26]朱胜梅,吴佳佳,徐 驰,等.环介导等温扩增技术快速检测沙门菌[J].现代食品科技,2008,24（7）：725-730.

[27]易海华,赵金伟,房 超,等.志贺菌环介导等温扩增检测方法的建立[J].中国公共卫生,2011,27（3）：380-382.

[28]徐 芊,孙晓红,赵 勇,等.副溶血弧菌LAMP检测方法的建立[J].中国生物工程杂志,2007,27（12）：66-72.

[29]易海华,何广会,房 超,等.使用环介导等温扩增技术快速检测金黄葡萄球菌的初步研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2010,30（4）：382-386.

[30]申建维,王 旭,范春明,等.等温扩增检测耐药基因mecA方法的建立及其临床应用[J].中华检验医学杂志,2006,29（2）：114-116.

[31]齐 哲,张 伟,刘卫华,等.FTA滤膜与环介导等温扩增技术结合快速检测消毒乳中的蜡样芽胞杆菌[J].中国食品学报,2009,9（3）：156-161.

[32]林 超,梁成珠,徐 彪,等.空肠弯曲菌LAMP快速检测方法的建立[J].微生物学通报,2009,36（6）：923-928.

[33]唐梦君,高玉时,周 生,等.应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究[J].中国动物检疫,2010,27（9）：25-28.

[34]张体银,郑 晶,黄晓蓉,等.环介导等温扩增技术快速检测食品中的单增李斯特氏菌[J].中国食品学报,2010,10（3）：200-204.

[35]鲁 曦,师宝忠,王 彬,等.LAMP法检测乳粉中的阪崎肠杆菌[J].现代食品科技,2010,26（5）：540-543.

[36]朱水荣,陈 寅,王志刚,等.环介导等温扩增法应用于肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7的检测[J].中华预防医学杂志,2009,43（9）：803-808.

[37]朱 海,吕敬章,范 放,等.E.coli O157：H7 LAMP检测方法的建立[J].分子诊断与治疗杂志,2010,2（2）：98-101.

[38]徐义刚,崔丽春,李苏龙,等.肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用[J].中国人兽共患病杂志,2010,26（7）：618-623.

[39]朱水荣,陈 寅,王志刚,等.应用环介导等温扩增法快速检测O139群霍乱弧菌[J].中华微生物学和免疫学杂志,2009,29（6）：564-567.

[40]程天印,刘 洵,常小斌.嗜水气单胞菌LAMP检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学,2007,37（12）：1013-1016.

[41]陈宗峰,王 滔,黄祖新,等.逆转录环介导等温扩增技术在诺如病毒基因检测中的应用[J].中国人兽共患病学报,2009,25（4）：340-343.

[42]耿英芝,姚文清,郭军巧,等.检测肠道病毒71型RT-LAMP技术的建立及其应用[J].中国人兽共患病学报,2011,27（3）：176-179.

[43]李月梅,薛书江,其木格,等.弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立[J].畜牧与兽医,2009,41（11）：30-32.

[44]杨秋林,张如胜,伍和平,等.应用环介导等温扩增技术检测弓形虫[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2008,26（4）：304-306.

[45]杨秋林,许丽芳,张愉快,等.环介导等温扩增技术检测日本血吸虫尾蚴的实验研究[J].中国血吸虫病防治杂志,2008,20（3）：209-211.

[46]杨秋林,许丽芳,张愉快,等.环介导等温扩增技术检测间日疟原虫的研究[J].中国病原生物学杂志,2008,3（8）：593-597.

[47]杨秋林,张如胜,伍和平,等.环介导等温扩增技术检测卡氏肺孢子虫的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2008,28（6）：565-567.