植物抗虫转基因研究进展

阮文丽，吴会会，刘乐承

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州434025)

植物抗虫转基因研究进展

阮文丽，吴会会，刘乐承

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州434025)

在介绍苏云金芽孢杆菌(Bt)、蛋白酶抑制剂(PI)、凝集素、淀粉酶抑制剂等植物抗虫转基因源的基础上，分析了抗虫转基因的应用现状，并对未来的研究与应用进行了展望。

植物；抗虫；转基因；苏云金芽孢杆菌；蛋白酶抑制剂；植物凝集素；淀粉酶抑制剂

自1983年成功获得世界上第一例转基因烟草后，转基因作物迅猛发展。在抗虫转基因实践中，目前已获得了几十种抗虫转基因农作物，部分转基因抗虫作物已进入大田试验，有的已进行商业化应用，展现出广阔的应用前景[1]。笔者综述了抗虫转基因研究的主要进展。

1 常用的抗虫基因源

1.1 苏云金芽孢杆菌

苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)属革兰氏阳性土壤杆菌，是一种存在于土壤中的孢子细菌。Bt在芽孢形成过程中产生的伴孢晶体蛋白[1]，伴胞晶体由具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成，这种蛋白通常被称为杀虫结晶蛋白(ICP)或δ-内毒素以及苏云金杆菌毒蛋白[2]。在昆虫幼虫的中肠道内借助于蛋白酶的水解，原毒素转型为多肽分子，活化了的毒素可以与敏感昆虫肠上皮细胞表面的特异性受体相互作用，诱导细胞产生一些孔道，扰乱细胞的渗透平衡，并引起细胞肿胀甚至产生裂解，伴随着上述过程幼虫将停止进食，最终导致死亡[3]。Bt转基因植物的细菌内毒素对某些害虫表现出较高毒性，而对人、有益昆虫和非目标生物几乎无影响[4]。

Bt杀虫晶体蛋白分为Cry类蛋白和Cyt 类蛋白2大类。目前应用最广的主要是Cry类 Bt杀虫晶体蛋白。根据杀虫谱的不同，将Cry杀虫基因分成7大类29个亚类[5]。转单一Bt基因的植物抗虫效率高，应用广泛。但在转基因植株体内，未加改造的Bt基因在转基因植物中表达水平很低，含量是植株内全部可溶性蛋白的0.001%以下，不能直接毒杀害虫。因此，必需对Bt基因进行修饰改造，以提高其在植株中的表达量及稳定性[1]。Bt杀虫蛋白基因产生作用较快较强，但是其抗虫谱较窄，且易产生耐受性[6]。

1.2 蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor, PI)是一类来源于动、植物和微生物，广泛存在于植物组织及器官中的一类天然抗虫蛋白质，主要分布在豆科、茄科、禾本科等植物的种子和块茎中，其含量高达总蛋白的1%～10%。与Bt毒蛋白相比，PI具有抗虫谱广、对人无毒副作用以及害虫不易产生耐受性等优点[5]。在进化过程中，PI分子活性中心部位的氨基酸残基的歧变速率明显高于蛋白酶，这暗示着植物PI的作用不在于调节体内蛋白酶的活性，而主要在于对抗外源蛋白酶的干扰[6]。

根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性，PI可分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶抑制剂。其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂可以明显抑制昆虫的生长发育[7]，因为大多数昆虫(包括大部分鳞翅目、直翅目、双翅目、膜翅目以及某些鞘翅目)肠道内的蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶；而巯基蛋白酶抑制剂则对以半胱氨酸类蛋白酶为主要消化酶的鞘翅目昆虫的防治有价值[8]。丝氨酸蛋白酶抑制剂和巯基蛋白酶抑制剂在抗虫谱上具有互补性。

植物PI的合成、积累、降解和诱导，以及昆虫蛋白酶的合成和调控等，都会影响PI的抗虫效果。植物生长发育过程中PI的合成是有阶段特异性的，即PI只在某一生长阶段合成，随后便会被降解[9]。此外，生物或非生物因素胁迫可诱导PI在植物体内的表达。

1.3 植物凝集素

植物凝集素(Lectin)是含有至少一个非催化结构域并能可逆结合特异单糖或寡糖的一类(糖)蛋白质[10]，存在于许多植物的种子和营养器官中[11]。Lectin是一类具高度特异性糖结合活性的蛋白，这是它们区别于所有其他植物蛋白的标志[12]。从总体结构上，Lectin可划分为部分凝集素、全凝集素、嵌合凝集素和超凝集素4类，而按进化和结构相关性则可分成7个家族。

正常情况下，Lectin仅作为储存蛋白而不表现任何特异活性，即行使其内源功能；一旦植物受到微生物、昆虫的危害，Lectin就会从植物的受害细胞释放出来，进入危害的消化道，与特定的糖结合引发毒性，行使其外源功能[13]。Lectin在自然界中分布非常广泛且在植物体内含量非常丰富，在植物不同发育阶段，以不同的方式保护着植物免受病虫害的侵害，是植物防御系统的重要组成部分[14]。

雪花莲凝集素(GNA)是目前已知抗虫效果最好和应用最广泛的凝集素[5]。而半夏凝集素(PTA)基因在水稻、玉米、小麦、烟草、百合、苜蓿等植株上成功转化后，对褐飞虱、二化螟、麦蚜、桃蚜等对刺吸式害虫均表现出一定的抗性。因此，半夏凝集素基因是良好的外源抗虫凝集素基因，是目前利用最成熟的首选外源基因[15]。

1.4 淀粉酶抑制剂

淀粉酶抑制剂在植物中普遍存在，但在禾谷类作物和豆科植物中分布较广。淀粉酶抑制剂基因能抑制昆虫消化道内α-淀粉酶活性，使食入的淀粉无法水解，阻断昆虫主要能量来源，它与淀粉酶形成的EI通过生理反馈调节作用，刺激昆虫分泌过量的消化酶，产生厌食反应[16]。淀粉酶抑制剂以1∶1的分子比与昆虫淀粉酶结合，从而抑制其活性[17]。

1.5 其他抗虫基因源

昆虫神经激素是已知三大昆虫激素的一种，它控制着昆虫许多关键的生理过程，影响昆虫的生长、变态、生殖、代谢和行为等。近年来，人们已开始在基因工程中利用昆虫神经激素防治害虫[18]。如蝎子、蜘蛛、毒蜂等动物或昆虫产生的毒素，可使害虫神经麻痹，使其失去知觉，不能取食而死亡；而且蝎子和蜘蛛产生的毒素一般只能专一性作用于昆虫，而对哺乳动物无害或毒性很小。另外，昆虫激素及有关代谢酶，如神经肤激素和保幼激素醋酶基因转入植物后可扰乱害虫体内激素平衡[19]。将昆虫激素基因引入植物或昆虫病毒，有可能干扰昆虫交配或栖息习惯或干扰昆虫的发育，从而达到控制虫害的目的[20]。

2 抗虫转基因的应用

抗虫基因在转基因作物植株上取得了良好的应用效果，如许多Cry蛋白、蛋白酶抑制剂和凝集素的转基因甘蔗株系对钻孔虫、允吸式害虫或蛆(蛴螬)有抗性[21]。

2.1 转Bt基因的应用

表达Bt内毒素的转基因作物可以控制一些害虫，并对虫害防治水平显著[4]。如转Bt基因草地早熟禾植株对1～2龄棉铃虫均具有抗性，其棉铃虫幼虫校正死亡率可高达70%以上[22]，且转Bt基因抗虫棉对棉蚜发育速度、成蚜寿命、4龄若蚜体重、成蚜繁殖力差异均无显著影响[23]；田间玉米螟对T5～T8代转Bt基因玉米叶片、茎杆、穗部危害程度极显著低于非转Bt基因玉米[24]。转CryI(c)基因和CryI IA基因的双价抗虫棉，不仅高抗棉铃虫等鳞翅目害虫，而且还抗双翅目等棉花害虫[25]。目前国外已培育出含2种Bt基因的抗虫棉新品种，并在生产上推广种植[25]。

2.2 转蛋白酶抑制剂基因的应用

利用大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因转化到烟草中，获得了具有明显抗棉铃虫能力的转基因烟草[26]。研究表明，甘薯块根中的一类贮藏蛋白sporamin蛋白有较强的胰蛋白酶抑制剂活性，而大多数植食性昆虫的消化酶属于胰蛋白酶类[27]，因此，植物蛋白酶抑制剂对多种昆虫的生长发育具有抑制作用[5，28]。

2.3 转植物凝集素基因的应用

自雪花莲凝集素基因被克隆以来，已经相继在十几种作物中得到成功转化，转基因植株均表现出一定的抗虫性[15]。半夏凝集素粗提液对棉蚜等刺吸式同翅目害虫致死作用显著，是一种有重要价值的抗虫基因[29]。Bt毒蛋白和蛋白酶抑制剂主要针对鳞翅目、直翅目、鞘翅目等咀嚼式昆虫，而植物凝集素基因不仅对鳞翅目、鞘翅目害虫有一定的效果，同时对蚜虫、叶蝉和稻飞虱等同翅目吸食性昆虫害虫也有较高的抗性，并对一些真菌病害也有一定作用。

2.4 转淀粉酶抑制剂基因的应用

小麦α-淀粉酶抑制剂(WAAI)和菜豆α-淀粉酶抑制剂(BAAI)目前研究的比较多。用转WAAI基因的烟草叶片喂养鳞翅目幼虫，其死亡率增加了30%～40%[30]。转菜豆α-淀粉酶抑制剂(α-A IPv)基因的烟草和豌对鞘翅目幼虫的生长发育有一定的阻碍作用，目前已从小麦和大麦中克隆出该基因转化到烟草中，能够准确、稳定地表达并在种子发育过程中积累[18]。

此外，有研究表明，转Bmk IT4(东亚钳蝎软瘫型昆虫毒素)基因烟草植株，对烟草天蛾、棉铃虫和大豆食心虫表现较强的抗性，并抑制昆虫发育[31]。

3 展望

对已克隆出的基因进行修饰、利用高效率的启动子调节基因表达水平是转基因技术后续的工作目标。如豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTI)表达量低，经修饰后，对转基因烟草、棉花、油菜、马铃薯及水稻鳞翅目、鞘翅目及直翅目害虫均表现出较好的抗虫效果[32]。

目前转双价抗虫基因引用较多的是Bt加CPTI，且抗虫效果较好。因为两者的拮抗和增效作用均衡时，蛋白酶抑制剂可抑制肠道中阻止Bt晶体蛋白失活的某些蛋白酶，从而增加Bt晶体蛋白的毒杀活性。如双抗虫基因(BtCrylAc和慈姑蛋白酶抑制剂)三倍体毛白杨，舞毒蛾定期死亡率高，且延续时间较长[33]。我国已开始研究将外源凝聚素基因与CPTI基因和Bt基因结合，构建三价转基因抗虫棉品种的遗传转化工作[34]。除开发利用动物、植物及微生物的潜在抗虫基因外，控制或影响昆虫重要生理代谢的基因也是一条可供选择的途径[20]。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.10.006

2012-09-22

阮文丽(1989-)，女，湖北武汉人，硕士生，研究方向为园艺植物生物技术。

刘乐承，E-maillchliu18@yangtzeu.edu.cn。

S435.112;Q789

A

1673-1409(2012)10-S023-04