维生素D生物学效价研究的一些新进展

石文标 谢 明 侯水生黄 苇 喻俊英

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

对于生物学效价，即生物学利用率(bioavailability)，Ammerman 等［1］将其定义为动物食入营养素中能被小肠吸收并参与代谢过程或贮存在动物组织中的部分占食入总量的比值。维生素D是一种必须经过代谢转变才能达到最佳钙化醇生物活性的脂溶性类固醇衍生物。皮肤合成的维生素D3或小肠吸收的维生素D由维生素D转运蛋白(vitamin D binding protein，DBP)运输，需在肝脏25－羟化酶(CYP2R1)和肾脏1α－羟化酶(CYP27B1)的催化下经2次酶促羟化反应形成最终的活性代谢产物 1，25－二羟基维生素D3［1，25-(OH)2D3］，与维生素 D 受体(vitamin D receptor，VDR)结合发挥生物学功能。由此可以看出，维生素D的生物学效价受合成、吸收、转运、催化等过程的影响。近年来，随着对维生素D在内分泌、自分泌/旁分泌、免疫调节及信号传导等功能上的深入研究，其越来越多地作为一种具有激素功能的物质被重新认识［2］。因此，从这一新的视角出发探究维生素D及其类似物的生理机制及生物学效价，对于传统维生素D研究的进一步发展是十分必要的。

1 维生素D生物学效价的评定方法

1.1 生物学方法

生物学方法包括“线谱鉴定”技术、外翻肠囊技术和动物活体试验。“线谱鉴定”技术是通过给患有严重佝偻病的模型动物饲喂维生素D饲粮一段时间后，对胫骨近端的钙化程度进行目测评分。此方法很耗时，并且误差达到30%。外翻肠囊技术一般是通过给维生素D缺乏的动物饲喂1次维生素D，待24 h后测量其肠道内钙转运速率和骨质动员速率的变化情况，以此评定维生素D的生物学效价。动物活体试验是在一定的饲养期内，用不同形式的维生素D(通常以维生素D2或维生素D3作为标准物)补饲相同摩尔水平的胆钙化醇活性基团到试验饲粮中饲喂试验动物。试验结束后对试验动物的多项敏感生理指标进行测定，然后用多元线性回归求斜率比等方法对数据进行分析整理，计算出不同形式维生素D间的相对生物学效价。这种方法简单易行，比较灵敏、准确、客观，但试验要求设定一定的浓度梯度，需使用较多的试验动物，并且所测得的结果只是相对利用率。由于该方法在使用时动物处于自然生长状态，其试验结果对生产实际具有指导意义，可作为其他研究方法的参照基准。

1.2 化学方法

化学方法的实质是将碱性皂化过程中维生素D的前体物质含量列为内部标准，通过高效液相色谱、竞争结合试验及放射受体分析等一些现代生化分析方法测定每一种维生素D代谢物或类似物的生物学活性，从而达到精确量化维生素D的目的。化学方法的误差是7% ～8%，但因其需要经过碱性水解、液－液萃取和固相萃取样品清理等繁琐步骤［3－4］，故此方法也相当费时。由于近10年来对25－羟基维生素D3［25-(OH)D3］生物学效价的研究越来越多，因此这种新的方法成为估测维生素D生物学效价的首选。

2 不同形式维生素D的生物学效价比较

从最初的维生素D3到25-(OH)D3再到最终代谢产物1，25-(OH)2D3，其生物学活性是成倍递增的。对大多数哺乳动物来说，维生素D3和维生素D2发挥着同样的生物学效应，但在禽类上维生素D3的生物学效价是维生素D2的10～30倍。Armas等［5］研究认为，维生素D2维持人血清25－羟基维生素D［25-(OH)D］水平的效力只有维生素D3的30% ～50%。这与Biancuzzo等［6］的研究结果并不一致，他们认为维生素D3和维生素D2的生物学效价不相上下，这可能与他们所用维生素D制剂的载体不同有关。Winter等［7］在体内和体外的研究试验表明，在促进肠道钙转运上维生素D3与25-(OH)D3的生物学效价基本一致。归纳以往的研究结果［8－10］，维生素D3及其代谢产物的生物学效价对比大体上为维生素D3≤24，25－二羟基维生素 D3［24，25-(OH)2D3］=25，26 － 二羟 基 维 生 素 D3［25，26-(OH)2D3］≤25-(OH)D3≤1，25-(OH)2D3。

3 维生素D生物学效价的影响因素

3.1 影响维生素D生物学效价的内在因素

3.1.1 活性维生素D的结构与DBP及VDR的亲和性

维生素D3化学结构的改变会导致其与VDR结合方式的改变，继而引起VDR构象的变化，影响靶基因转录水平的表达，最终改变维生素D3的生物学效价［11］。DBP作为血清中维生素D代谢产物的主要载体，以3个主要的多态性形式存在，不同形式的DBP对维生素D的生物学效价有潜在的影响。最近的研究表明，维生素D一些生物学功能的发挥与血清游离的25-(OH)D浓度关系更紧密，而非这种代谢产物的总浓度［12］。血清25-(OH)D的总浓度相对较低时其游离的25-(OH)D浓度较高，而DBP的高亲和性可能导致游离的25-(OH)D浓度的降低［13］。除了运输功能外，DBP能够将血清中维生素D代谢产物的循环浓度维持在稳定水平，而且DBP可延长维生素D及其代谢产物的半衰期，并使得它们更易被靶组织吸收，因此可以影响一些器官的代谢反应，调节生物学效价［14］。

维生素D3的结构改造主要包括侧链的结构改造和A环的结构改造。这些结构的改造及构象的修饰能够改变维生素D与DBP及VDR的亲和性，使它们与钙代谢平衡调节、细胞诱导分化和增殖抑制等生物学功能彻底分离，从而影响维生素D的生物学活性。有研究表明，1α－羟基在维生素D与DBP及VDR结合的过程中至关重要，一些基团取代1α－羟基后，其类似物的生物活性与1，25-(OH)2D3相比均有显著降低［15－16］。随C －2位α－羟烷基的碳原子数增加，类似物的VDR亲和性及诱导细胞分化活性逐步升高，其中α－羟丙基的VDR亲和性最高，为维生素 D3的3倍［17］。因此，进一步研究活性维生素D3的构效关系对于维生素D3生物学效价的研究发展十分必要。

3.1.2 关键酶的活性及其反馈调节机制

维生素D的代谢过程中有多种羟化酶发挥作用，其中起关键作用的酶主要是 CYP2R1、CYP27B1和24－羟化酶(CYP24)。它们的活性和基因转录表达水平可通过正负反馈调节机制受不同因素的调控。肝脏中的CYP2R1被认为是维生素D发生25－羟基化所需的关键酶，CYP2R1基因发生突变后血清中25-(OH)D3循环水平降低，并同时出现典型的维生素D缺乏症状［18］。血清中25-(OH)D3能够直接抑制CYP2R1的活性，这种负反馈调节机制对于维持稳定的血清25-(OH)D3水平非常重要［19］。

CYP27B1影响维生素D代谢产物的生物学效价，低钙磷饲粮会导致CYP27B1活性的增加［23］，而高钙低磷饲粮会下调肾脏CYP27B1基因表达水平，从而说明饲粮钙对CYP27B1活性的影响较大，而饲粮磷对CYP27B1活性的影响不大［22］。除此之外，甲状旁腺素(PTH)［20］、降钙素［21］、催乳素［24］也可通过调节 CYP27B1 基因的转录表达而影响1，25-(OH)2D3的合成。而单核细胞和巨噬细胞中CYP27B1的调节机制与肾脏有所不同。由巨噬细胞产生的CYP27B1其基因受免疫刺激物(如γ－干扰素和脂多糖)的刺激通过多种途径［如Janus激酶/转录激活因子(JAK/STAT)通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核转录因子－κB(NF-κB)］而上调表达。免疫刺激也需要 CCAAT/增强子结合蛋白 β(C/EBPβ，又称NF-IL6)结合到CYP27B1启动子区域的识别位点上才能实现对其转录的激活［25－26］。这表明动物体的自身免疫状态可以通过调控某些免疫细胞中CYP27B1基因的转录表达来影响维生素D代谢，从而影响维生素D的生物学效价。

肾脏中的CYP24可以羟基化25-(OH)D3和1，25-(OH)2D3，其主要功能是降低维生素D的生物学活性。CYP24与1，25-(OH)2D3之间是相互调节的，1，25-(OH)2D3刺激CYP24活性增强，而低钙和低PTH抑制其活性。有研究表明，胎盘中CYP24活性的降低可导致胎儿－母体接口处1，25-(OH)2D3生物学效价的增加［27］。而转录因子C/EBPβ、SWI/SNF、辅活化子结合精氨酸甲基转移酶1(CARM1)和G9可与VDR共同作用于CYP24的转录调控［28－30］，成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23，FGF23)和 klotho蛋白也可通过调节CYP27B1与CYP24基因的表达而参与1，25-(OH)2D3的自动抑制调节，从而影响其生物学功能的发挥［31］。

3.2 影响维生素D生物学效价的外在因素

3.2.1 试验动物及光照

不同种类的动物对维生素D的吸收利用能力差异很大。维生素D2和维生素D3的生物学效价在不同物种中所测得的结果存在一定的差异，而动物的自身状况(如免疫状态［32］、年龄［33］、肥胖［34］等)也与维生素D的生物学效价有关。皮肤中的7－脱氢胆固醇经紫外线照射形成维生素D3前体，进而转化成维生素D3。紫外线光照的变化显著影响这一过程，进而影响维生素D生物学效价的测定。有研究利用电脑建模技术估测，1单位最小红斑剂量(MED)的紫外线光照在人体中可以产生相当于口服16 000 IU维生素D的效力［38］。肉鸡光照试验结果表明，皮肤经紫外线照射所产生的胆钙化醇量相当于饲喂10 μg/kg的25-(OH)D3［40］或 20 μg/kg 的维生素 D3［39］。因此，紫外线照射强度的不同也是导致维生素D生物学效价没有一致结论的因素之一。

3.2.2 评价指标及评价方法

在维生素D生物学效价的研究试验中，采用不同的测定方法及指标所测得的结果不同，生物学方法所测得的结果比化学方法要低20%左右。不同的试验采用的指标各异，主要包括生产性能指标(体重、日增重、采食量和料肉比)、胫骨指标(骨灰分和骨钙磷)、血清指标［钙磷水平、25-(OH)D水平、碱性磷酸酶活性］、钙吸收代谢指标(肠道钙转运速率、骨钙动员速率)等。近年来，血清PTH水平也被作为评定维生素D生物学效价的指标之一［35－36］。Emily 等［37］在鼠上测定维生素D2与维生素D3生物学效价时发现，以血清25-(OH)D水平为评价指标时维生素D2的生物学效价低于维生素D3，而以骨矿物质密度、骨矿物质含量等为评价指标时这两者基本相等。因此，评价指标及评价方法的选择对于评价维生素D的生物学效价特别重要。

3.2.3 维生素D载体

饮食中维生素D的载体是不同的，一般包括油、粉末及乙醇。载体对维生素D的生物学效价有非常重要的影响［41］。有研究报道，乳糖作为维生素D载体时其效价是油的1.09倍［42］，是纤维素的1.42倍［43］;而油作为维生素 D载体时其效价是乙醇的 4.25 倍［44］，是多维的 1.13 倍［45］。乳脂性食品是维生素D理想的载体，因为其所含的脂肪成分可以增强脂溶性维生素D的稳定性，促进其吸收［46］，尤其是奶酪制品中所含的β－乳球蛋白和β－酪蛋白，能够强力结合维生素D，形成保护性的结构，避免在极性环境中被破坏，从而影响了维生素 D 的生物学效价［47－48］。

4 小结

随着维生素D生物学效价评定方法的不断完善及快速普及，研究的结果也逐步呈现出一致性，但由于某些影响因素的存在导致了一定的差异性，对维生素D生物学效价的研究仍然没有统一的结论。因此，确定一个最合适的评价体系是今后研究的重点。此外，随着流行病学、动物学、细胞学、生物化学以及分子遗传学研究的进展，人们对维生素D的生物学功能有了更深一步的认识，这为从细胞水平和分子水平上探究维生素D生物学效价新的评定方法提供了可能。

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