基于核磁共振的代谢组学在动物营养中的应用

邹 云 贺建华谢红兵 杨永生 江碧波 李江长

(湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128)

代谢组学作为一种高通量、高灵敏度、高精确度的现代分析技术，目前在各个领域的应用已经成为了研究的热点［1］。后基因组时代的到来驱动着技术的不断进步，使细胞和整个生物体的功能在分子水平上得到探索和发展。传统的动物营养研究运用化学分析、消化代谢试验、平衡试验、饲养试验技术等研究营养物质的消化和代谢吸收，这些方法测得的生物学指标比较单一、表观性强，无法全面反映机体动态营养代谢变化。而代谢组学能测量与生物体有关的整套低分子质量代谢产物、生物体体液或组织的代谢图谱，可以视为生理或病理状态的重要指标。这种图谱对动物细胞调控机制提供了更全面的观点。因此，代谢组学日益成为整体性研究动物营养的重要分析技术。本文简要综述了代谢组学概念、特点和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技术及其在动物营养研究中的应用。

1 代谢组学的概念和特点

1.1 代谢组学概念

在1983年Nicholson首次运用NMR技术对大鼠的全血及血清进行了研究，随后运用NMR技术分析大鼠的尿液［2－3］，并对NMR的技术提出了展望，于1999年提出了代谢组学的概念［4］。目前，代谢组学被大家所接受的2种定义，一种是metabonomics，Nicholson等［4］将其定义为“定量测定病理生理刺激或基因改变情况下生物系统的动态多参数代谢物变化”;另外一种是metabolomics，最早出现在Fiehn小组的工作中，主要以研究植物生理代谢网络为目的，其分析技术主要以气相色谱 － 质谱(GC-MS) 为主［5］。Oliver［6］将其定义为“全面、定量分析生物体系中所有代谢物”。前者多以动物的体液和组织为研究对象，应用NMR技术进行健康与疾病研究，强调的是动态的分析，研究的是生物体在病理生理刺激或基因修饰下其所有代谢物质在不同时间的动态变化规律。后者多以细胞为研究对象，主要应用GC-MS技术，强调的是静态的分析，是通过定性和定量地分析生物体所有代谢物的组成来研究生物代谢途径的一种技术。如今两大流派已经相互交融，研究手段也涵盖了NMR、GC-MS和液相色谱－质谱等技术。

1.2 代谢组学的特点

代谢产物是基因与环境共同作用的结果，能直接反映生物体的状态，运用代谢组学技术分析代谢产物，能全面考察外源性物质对生物体产生的整体效应，对于阐明机体复杂变化具有重要意义。与转录组学和蛋白质组学相比，代谢组学具有以下优点［7－8］：1)基因表达和蛋白质合成的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易;2)代谢组学的技术不需建立全基因组测序及大量表达序列标签的数据库;3)代谢物的种类远小于基因和蛋白质的种类;4)代谢产物在各个生物体系中都是类似的，故代谢组学研究中采用的技术更通用;5)代谢组学的研究标本容易获得，而且无需进行复杂的预处理。

2 NMR技术

代谢组学研究中常运用的技术有质谱、色谱、NMR、红外光谱、紫外吸收等，目前，NMR技术已成为代谢组学的主要研究手段，广泛地应用于各个领域。NMR技术是基于原子核磁性的一种波谱技术，利用其原理可以鉴定化合物结构。由Nicholson等［9］提出的基于NMR的代谢组学研究生物体对外源性物质所引起的病理生理反应，以及对遗传变异的应答和内源性代谢物的动态变化，通过对生物体液和组织中随时间改变的代谢物进行检测、定性、定量和分类，将这些代谢信息与病理生理过程中生物学事件关联起来。

基于NMR的代谢组学最常用的是氢谱，与传统的检测方法相比，NMR的特点是：样品只需进行简单预处理甚至不需要处理，样品用量少，测定时间短，一维谱的测定只需5～10 min，可以同时对所有代谢物进行定量分析，定量测定不需要标样;没有损伤性，不会破坏样品的结构性质，能够保持样品的完整;无偏，是一种非选择性测定技术，对所有化合物的灵敏度是一样的;可以在接近正常生理条件下试验，也可在一定温度和缓冲液范围内选择试验条件;可以进行实时动态检测，试验方法灵活多样;1H、13C、15N、31P的NMR谱都可以应用于代谢组学研究，一维核磁共振氢谱(1HNMR)对含氢化合物都有响应，因为1HNMR的谱峰与样品中各化合物的氢原子是一一对应的，所测样品中的每一个氢原子在图谱中都有其相关的谱峰，图谱中信号的相对强弱反映样品中各组分的相对含量;操作方法简单快速，测量精确，重复性高;测量结果受样本大小与外观色泽的影响较小，且不受操作员的技术和判断所影响。因此，NMR方法很适合研究代谢产物中的复杂成分，通过NMR技术获得代谢指纹图，然后通过模式识别方法，提取有关代谢组变化的信息，得出相应的有价值的生物学信息，再对这些生物信息统计分析和研究，了解机体生命活动的代谢过程。但NMR也有其缺陷，主要是灵敏度不够高，不适合分析同一样品中浓度相差很大的物质，动态检测范围也有一定的局限性。

3 基于NMR的代谢组学在动物营养研究中的应用

随着后基因时代的到来，技术的不断进步，动物营养研究也在不断深入。但仍然面临着很多问题，卢德勋［10］指出我国动物营养学面临的任务除了继续对动物营养需要量和饲料营养价值评定进行深入研究外，还要加强对营养物质调节机制、宏观层次的营养信息传递机制、机体自我营养调控功能以及环境包括应激对机体营养代谢和利用的影响和机制的研究。要解决这些问题，新技术和新方法就成为了关键，基于NMR的代谢组学能实现大量重复数据的采集与分析，为养殖提供新的技术支持，为动物营养研究提供新思路，为畜牧业发展提供新的前景。

3.1 基于NMR的代谢组学在动物营养需要量研究中的应用

基于NMR的代谢组学可用于构建基于代谢标识物的营养需要量评估模型，辅助评价动物营养需要量。营养素摄入过多或不足都会引起机体代谢失调，运用基于NMR的代谢组学分析与常量营养素摄入过多或不足相关的代谢产物，从而可以确定常量营养素的适宜需要量。Noguch等［11］表明用代谢组学的方法可以定量测定氨基酸代谢物，可估计摄入适量的氨基酸与安全范围，可研究某种代谢产物与摄入过量的蛋白质、氨基酸的相关性，以此确定适量安全的氨基酸摄入量。Matsuzaki等［12］对过量摄入亮氨酸的大鼠血浆代谢组学分析表明，尿素和α－酮异已酸可能是氨基酸过量摄入时的标识物。Toue等［13］通过基于NMR代谢组学技术研究蛋氨酸代谢的标识物，揭示了高半胱氨酸是监测蛋氨酸是否过量的良好指标。王小雪［14］利用代谢组学的技术及思路研究家猫对高蛋白质饮食的代谢应答，结果表明NMR研究方法可以用于区分和评价高蛋白质饮食对家猫机体代谢的影响，从而为该动物的蛋白质需要量提供依据。He等［15］研究表明，基于NMR代谢组学技术可用于功能、代谢调节和氨基酸需要量研究，运用代谢组学技术确定饲粮中氨基酸在维持健康和减少疾病的作用方面是非常有前景的。这些试验充分说明利用基于NMR的代谢组学技术探索动物营养需要量是可行的，相对于常规方法，代谢组学有不可替代的优势，今后将更广泛应用于动物营养研究中。

3.2 基于NMR的代谢组学技术用于评价营养物质对机体的影响

基于NMR的代谢组学技术不仅可以研究动物营养需要量，在营养物质对机体影响研究中也可发挥重要作用，主要用于研究营养物质引起的内源性代谢物的变化，更直接反映体内生物化学过程和状态的变化，从而揭示营养物质对机体影响。Solanky等［16］运用基于 NMR的代谢组学研究发现，表儿茶素(EC)使SD大鼠内源代谢物水平发生明显变化，EC进入体内影响内源性物质的代谢途径，代谢能力降低，碳水化合物代谢水平下降，还可能引起肝脏、肾脏功能改变等。Lamers等［17］用代谢组学技术研究了不同剂量的维生素C对豚鼠骨关节炎的作用，收集尿液进行NMR分析，结果表明不同剂量的维生素C对豚鼠骨关节炎的 影 响 有 所 不 同。Martin 等［18］运 用 基于1HNMR的代谢组学方法评估以不同乳制品为主的饲粮对高脂血症仓鼠早期动脉粥样硬化的影响，结果表明，食物环境可以起到调节动脉粥样硬化的作用。此次试验首次使用代谢组学方法分析由饲粮不同引起的动脉粥样硬化，揭示了新的潜在疾病的生物标识物。Bertram等［19］利用基于NMR的代谢组学的方法来探索分别以黑麦或小麦为主的富含纤维的饲粮对高胆固醇血症猪内源性生化效应的影响，揭示了高胆固醇血症猪摄入高纤维黑麦饲粮后，血浆碱含量增加，并找出了评价血浆碱含量的标识物。He等［20］采用基于NMR的代谢组学技术对饲粮中添加精氨酸对生长猪的影响进行了研究，发现增加饲粮中精氨酸添加量能改变机体脂肪和氨基酸的代谢过程，提高骨骼肌中蛋白质的合成，调节肠道微生物的代谢，显著提高猪的生长性能。

3.3 基于 NMR的代谢组学研究动物在不同状态下代谢差异和代谢机制

基于NMR的代谢组学技术还可用于特殊状态下的代谢差异和代谢机制研究。Duarte等［21］阐述了利用NMR代谢组学方法研究哺乳动物细胞代谢，这些研究包括在细胞特性(例如耐药性、细胞周期的阶段、具体的生长条件和遗传特征)的差异和在不同干扰条件(例如疾病、药物暴露和照射)下诱发的变化。Williams等［22］使用1HNMR和高效液相色谱－质谱技术研究老龄化对雄性老鼠尿液中内源性代谢物的影响，发现标识物(包括牛磺酸、肌酐、马尿酸和相关的氨基酸/脂肪酸)随着年龄的增加而增加，而柠檬酸和共振产生葡萄糖/肌醇下降，这些技术在研究老鼠老龄化和代谢物关系中发挥了重要作用。Gao等［23］利用1HNMR方法检测幽门螺旋杆菌感染的沙鼠，试验结果显示幽门螺旋杆菌的感染干扰了碳水化合物的代谢，提高α－葡萄糖、β－葡萄糖和顺乌头酸的含量。除了能量代谢改变，定植于沙鼠胃的幽门螺旋杆菌还造成氨基酸代谢的显著变化，牛磺酸和精氨酸耗竭，而动物尿液中的脯氨酸和谷氨酰胺含量的升高。此外，幽门螺旋杆菌感染改变了肠道菌群的一系列微生物相关的代谢产物，如吲哚酚硫酸盐和马尿酸。李民等［24］进行了营养不良大鼠血浆小分子物质代谢组学的研究，结果表明营养不良组大鼠与正常大鼠相比，血浆中肉毒碱和色氨酸含量增加，而甜菜碱、棕榈酰肉碱、亚麻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸等含量均降低，因此代谢组学可作为营养不良指标的筛选方法。Bertram等［25］选取40头生猪研究了屠宰前的运动负荷对屠宰时血浆代谢物的影响，结果表明在没有休息组和对照组之间的血浆代谢图谱有明显的差异，这主要可以归因于屠宰前运动增加血浆乳酸含量，屠宰时的血浆代谢物轮廓与屠宰后1 min肌肉温度、肌肉系水力高度相关，乳酸被认为是联系血浆代谢物、pH、温度和系水力的重要的标记物。刘霞等［26］运用基于1HNMR代谢组学方法分析马兜铃酸Ⅰ诱导的雌雄小鼠急性肾毒性，揭示马兜铃酸导致急性肾毒的分子机理，即抑制了体内三羧酸循环和能量代谢，破坏了肠道菌群的平衡，引起了肾小管的损伤。Li等［27］通过 NMR技术研究羊在长期道路运输过程中脂肪酸的代谢变化，揭示了运输动物经历肠道代谢、能量代谢、肌肉代谢的变化，还有可能肾脏应答变化，经过48 h运输的动物表现了更强烈的代谢反应，并且在72 h后才能恢复原来代谢轨迹。Zhang等［28］运用1HNMR结合多元统计技术进行了单侧输尿管梗阻所致肾间质纤维化大鼠的血清样品的代谢变化研究，结果表明肾间质纤维化组大鼠的代谢图谱与对照组有很大差异，在单侧输尿管阻塞大鼠中，一些代谢产物如缬氨酸、异亮氨酸、乳酸、3－羟基丁酸、丙氨酸、醋酸、乙酰乙酸、丙酮酸、谷氨酸的水平和时间相关，肾间质纤维化大鼠的脂质代谢和酮体的合成代谢增强，早期纤维化能量代谢转弱，晚期增强。这些试验充分说明了基于NMR的代谢组学在研究动物代谢差异和代谢机制方面发挥的重要作用。

3.4 基于NMR的代谢组学在动物食品安全方面的应用

动物食品安全关系着人类的健康，利用NMR的代谢组学研究兽药在动物体内的残留。寻找违禁药相关的生物标志，预测其残留效应与毒性，将使动物性食品安全的评估工作变得高效而便捷。陈卫江等［29］运用NMR技术对猪肉进行二维成像，从信号成像的质量效果入手，在改变成像参数的情况下分析图像变化规律，将有利于今后对猪肉进行NMR成像的质量分析的开展，提供了一种研究食品物质性质的方法，有利于肉制品质量的快速定级。Dumas等［30］用代谢组学方法，以区分具有不同生理背景(年龄、性别、品种)不同类固醇治疗下奶牛尿中的生物标记。代谢产物中二甲胺、三甲胺－N－氧化物、马尿酸、肌酸、肌酐、柠檬酸等在代谢图谱中具有不同特征。这些尿中生物标志物揭示了在氮和能量代谢中的变化。在这项研究中取得的成果，现在可以考虑将代谢组学方法作为一种辅助方法用来检测滥用药物的奶牛。Bertram 等［31］对白肌(PSE)肉和黑干(DFD)肉在冻藏过程中的水分活度和分布的变化进行研究，结果表明，NMR对冻藏诱发的肉结构变化以及结构变化所产生的水分迁移非常敏感，随着冷冻时间的增加，猪肉中自由水的含量也明显增多，揭示运用代谢组学技术可以检测猪肉品质。基于NMR的代谢组学在动物食品安全中的应用，远不止以上所列举，还可以检测肉的pH、氧化还原作用、乳制品中微生物含量等。

4 小结

代谢组学在动物营养中的应用处于起步阶段，今后，基于NMR的代谢组学技术将在动物营养研究中发挥越来越重要的作用。但是，NMR技术仪器造价昂贵，目前在国内动物营养领域中还没有普及，此外复杂的数据处理也限制了其发展，因此在今后研究中，要开发代谢组学数据处理软件，加强代谢组学研究条件的建设，构建动物营养代谢组学研究体系，集中解决这些问题，为其在动物营养领域的研究提供条件。

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