膀胱肿瘤标志物的研究进展

王泽民，于 满

(1.承德医学院，河北承德 067000;2.承德医学院附属医院)

2010年，北美膀胱肿瘤新发患者达到70530例，同时有14680例死亡病例的致死病因与膀胱肿瘤有关。膀胱肿瘤已经是北美第四常见肿瘤，在恶性肿瘤导致死亡事件中排名第九，男性与女性膀胱肿瘤患者的比例为3:1[1]。在我国，膀胱肿瘤也是常见恶性肿瘤之一，并且膀胱癌发病率呈上升趋势，占全部恶性肿瘤的3.2%,90%以上为膀胱移行细胞癌(BTCC)，其中又以浅表移行细胞癌为主，术后约60%-70%复发[2]。近年来，新的膀胱肿瘤检测方法不断出现，显著提高了膀胱肿瘤诊断及预后判断水平。很多探索研究的膀胱肿瘤分子标记物均对膀胱肿瘤的诊治有帮助，但目前未发现特异性及灵敏度出众的膀胱肿瘤分子标记物[3]，寻找这方面的肿瘤标记物已成为热点问题。本文将其研究进展综述如下。

1 核基质蛋白(NMPs)

核基质蛋白是一种DNA组蛋白，也是细胞核网状结构形成必需的成份，在基因的复制、转录和翻译的过程中起重要作用，不同肿瘤细胞均伴随着核基质蛋白成分及结构的不同程度变化。有学者曾对核基质蛋白家族的成员核基质蛋白-22(NMP22)进行研究，认为检测NMP-22对提高膀胱癌复发的判断有帮助，但尿路上皮细胞更新脱落的因素很多，导致易发生假阳性，且假阴性高，未能广泛用于临床。膀胱癌特异性核基质蛋白-4(BLCA-4)是新发现的9种膀胱核基质蛋白中的一种，只在膀胱癌组织中表达，而在正常人膀胱组织中缺乏。BLCA-4作为一种转录因子可引起许多基因表达的异常，如IL-8是一种炎性细胞因子，可引起微血管病变，在包括膀胱肿瘤在内的多种肿瘤中都有表达，并影响着肿瘤转移，高表达BLCA-4的转染细胞中IL-8含量升高12倍，BLCA-4参与了IL-8在膀胱肿瘤细胞中的表达调控。此外，BLCA-4与IL-1的表达也有协同促进作用，导致肿瘤细胞与内皮细胞粘附，加快瘤细胞浸润。BLCA-4与许多已知因子如AP-2、NF—E1等共同作用于DNA顺式作用元件，在膀胱癌的产生中也发挥重要作用。Konety等[4]通过对膀胱肿瘤细胞核基质研究制备了BLCA-4抗体，并进行免疫斑点分析，在膀胱癌组织和癌旁怀疑病变组织均可检测到BLCA-4表达，而在正常组织中无阳性发现，敏感性96.4%，特异性高达100%，认为BLCA-4水平的检测对提示早期膀胱癌的复发有价值。Getzenberg等[5]在正常膀胱组织与膀胱癌组织的对比研究中证实了新膀胱核基质蛋白的存在，并指出BLCA-(1-6)在膀胱癌组织中表达，正常膀胱组织无表达，其中膀胱癌特异性核基质蛋白-4(BLCA-4)的敏感性及特异性均佳，可能作为膀胱癌的特异性标志物，对诊断膀胱癌及术后随访有重要价值。Van等[6]在诱导的大鼠膀胱癌模型的研究中发现，在人工膀胱灌注致癌物后的第8周，BLCA-4已可检测到表达，认为BLCA-4是膀胱癌发生的早期事件，对检测术后膀胱肿瘤复发有参考价值。BLCA的其它成员在膀胱癌诊治及术后随访中是否更有意义，目前尚无进一步报道。BLCA-4蛋白在膀胱肿瘤中作用的详细机制还需要深入研究，虽然目前尚无商品化试剂盒，但BLCA-4作为一种无创术后监测方法的临床应用前景依然受到关注。

2 P53蛋白

近年来，P53基因在人类肿瘤中参与细胞周期的调节和细胞凋亡作用有较多研究，P53基因位于人类染色体17p13.1上，由11个外显子和10个内含子组成，分野生型和突变型，并分别转录、翻译野生型和突变型P53蛋白。野生型P53蛋白半衰期仅6-20min，易水解，一般难以检测出来，突变型P53蛋白半衰期较长，常在细胞核内聚积，因此，用免疫组化方法检测到的P53蛋白均为突变型P53蛋白[7]。

2.1 野生型P53基因的作用 野生型P53基因能调控细胞增殖，是一种重要的抑癌基因。正常体细胞P53基因编码分子量为53 000的核磷酸结合核蛋白(P53蛋白)，又称为野生型P53蛋白，野生型P53基因的抗肿瘤作用，可通过调节下游效应基因MDM2、PIG3等阻止DNA异常的肿瘤细胞进入S期，影响基因转录，干扰DNA的起始、启动细胞的终末分化和程序化死亡，阻止细胞转化，促进凋亡[8]。当正常细胞DNA双链受损时，可诱导野生型P53基因表达为P53蛋白并激活，它会降低Topoisomerase II的活性，实现控制细胞分裂。野生型P53蛋白在转录水平激活众多阻止受损细胞继续增殖的基因，如Gadd45基因、周期蛋白G、凋亡诱导因子bax、PUMA基因等，可通过切补修复、错配修复等方式修复受损DNA，如修复未成功，则会阻止受损DNA的复制叉前进，抑制DNA的复制，刺激DNA切除修复，并激活caspase酶启动细胞凋亡程序[9]。Yamauchi等[10]在对鼠进行实验时发现，当鼠胚胎神经细胞及滋养层细胞的DNA损伤后，P53的转录增加，作用于靶基因Cyclin G1、P21等表达增强，监控组织细胞增殖和神经正常再生。

2.2 突变型P53基因的作用 野生型P53基因是人类肿瘤中较易突变的基因之一，很多肿瘤组织中均有不同程度的P53基因突变，如乳腺癌、肺癌、胃癌及膀胱癌等。突变型P53基因有致癌作用，Braithwaite等[11]研究提示，野生型P53基因突变导致DNA构象发生改变，扩增无节制，失去P53的调节后，不但丧失了本身的抑制受损细胞复制、诱导凋亡、修复DNA等抗癌功能，而且可抑制周围野生型P53基因的正常功能，使癌细胞更加耐药。

研究者们对P53在不同分期、分级的膀胱肿瘤及复发肿瘤组织中进行实验，试图发现P53突变及表达的规律。Fu等[12]认为P53在良恶性肿瘤中差异明显，但不同的表达水平对肿瘤的分期、分级及预后无显著作用。而温机灵等[13]研究显示，突变型P53表达与膀胱肿瘤病理分级、临床分期呈正相关，P53表达显著升高时，肿瘤极易进展，复发风险高还有学者[14]对P53在膀胱小细胞癌中的表达及对预后影响的研究认为，P53过度表达在病理分级Gl、G2、G3中分别是6%、28%、71%, Tis-T1期表浅膀胱癌的表达率为19%T2-T4期表达率为59%，P53的表达与膀胱癌的病理分级临床分期呈正相关，随着膀胱肿瘤恶性程度的进展，P53蛋白表达增强。张晓辉等[15]认为，复发的膀胱移行上皮癌表达P53较非复发膀胱移行上皮癌明显增多，显示P53表达阳性的肿瘤复发的可能性大，指出P53的高表达可以作为膀胱肿瘤复发的指标。继续深入研究P53在膀胱肿瘤中的作用可以为临床改善膀胱肿瘤预后提供新思路。

3 血管内皮细胞生长因子(VEGF)

膀胱肿瘤的血管丰富，其生长、浸润、复发等与肿瘤新生血管生成密切相关。肿瘤的生长、侵袭及转移是以供养血管的不断生成为前提的，当肿瘤体积微小时，细胞通过周围组织的弥散作用获得的营养足以维持生存，并可排泄废物随着肿瘤的不断增大，氧气及营养物质需求增加，新生毛细血管的长入，使肿瘤组织避免进入休眠期，获得新鲜血液灌注的肿瘤组织开始生长失控，体积倍增，同时，毛细血管内皮细胞分泌的生长因子对肿瘤生长有促进作用，新血管生成本身就是一种侵袭行为，细胞间的胶原连接被破坏，形成肿瘤细胞所喜欢的纤维蛋白基质[16]。

3.1 VEGF在肿瘤中的作用 VEGF基因位于人染色体6p12处，其表达产物相对分子质量为34 000-45 000的外分泌性糖蛋白，是目前认为特异性刺激血管内皮细胞增殖活性最强的调节因子，它可以增加血管通透性，使肿瘤血管内皮细胞增殖，促进新生血管的蔓延，从而加速肿瘤生长与转移，在膀胱肿瘤的生长、浸润、转移中起重要作用[17]VEGF可与细胞表面受体结合，启动细胞内一系列转录因子，它使促进血管生成的蛋白表达增多，肿瘤组织形成大量结构和功能异常的血管，给恶变细胞快速侵袭生长创造了机会。Jacobsen等[18]在研究影响肾细胞癌的预后因素时指出，恶性肿瘤组织可以分泌大量VEGF蛋白，体现在患者的血清中VEGF表达明显增高，血清中VEGF水平较高时，损坏微血管基底膜，纤维蛋白容易附着于血管内壁，形成血栓，引起癌细胞进入血液循环，形成转移灶，并随血液循环到达远隔器官。

3.2 VEGF的表达机制 VEGF的表达有赖于癌基因的激活、抑癌基因的失活和多种因素(如缺氧等)参与，但VEGF的具体表达机制及其调控还是未知。Weigand等[19]研究认为，肿瘤细胞可以自主分泌VEGF，细胞间质中的VEGF又与自身受体结合，从而促进肿瘤血管增殖，并试图用VEGF siRNA来抑制VEGF的分泌，减少VEGF与其细胞表面受体的结合，实现抗肿瘤目的，结果显示是可行的。Wu等[20]在人类膀胱肿瘤细胞VEGF的表达及信号传导的研究中证实14种膀胱癌细胞株中有11种细胞株发现表达1种或1种以上的VEGF受体，VEGF与该类受体结合可以促进细胞增殖，但阻断或干扰该信号通路可抑制肿瘤细胞DNA的合成，使T24细胞阻滞在G0/G1期。Giatromanolaki等[21]的研究结果显示，膀胱肿瘤组织表达VEGF的路径受多种因子调节，如野生型P53能够下调内源性VEGF mRNA的转录水平，并抑制VEGF启动基因。可见VEGF mRNA的大量翻译需要肿瘤细胞P53基因突变或丢失，肿瘤组织中突变型P53与VEGF的表达存在协同关系。

3.3 VEGF在膀胱肿瘤中的表达情况 研究者有不同意见。0’Brien等[22]对53例膀胱标本进行实验，其中膀胱癌45例和正常膀胱组织8例，结果显示膀胱癌中VEGF的表达率显著高于正常膀胱组织，并且复发的浅表性BTCC中VEGF的表达程度是未复发者的4倍，作者认为VEGF是研究BTCC生物学行为的重要标志物。但Campell等[23]研究结果说明，膀胱肿瘤组及肿瘤复发组VEGF蛋白表达无统计学差异，作者并未否认VEGF mRNA表达在不同病理组间存在差异，是什么因素影响了翻译过程尚不清楚，可能因VEGF会明显增强其它因素如tsp-1等在膀胱肿瘤生长中的促进作用，而实现对肿瘤的间接影响。Crew等[24]报道，VEGF在膀胱癌患者尿液中含量明显高于健康人群，且复发者含量又高于初发者，认为尿中VEGF含量升高预示膀胱癌的高复发风险和不良预后。探索抑制肿瘤血管生长的基因靶点，为临床膀胱肿瘤基因治疗提供了新路径，VEGF在膀胱肿瘤中的作用机制需要继续研究。

4 增殖细胞核抗原(PCNA)

自从1978年Miyachi发现了PCNA基因，一直对PCNA作为增值性标志物进行研究。PCNA基因位于第20对染色体，其表达产物PCNA蛋白属于非组蛋白，在细胞核内合成，分子量为36 000，它作为细胞周期蛋白(Cyclin)是真核生物DNA聚合酶δ(Polδ)的辅助蛋白，在细胞核内不同部位均有表达，并直接参加 DNA 的合成，调节细胞周期。当细胞周期开始DNA复制时，以前导链为模板，dNTP为原料合成冈崎片段，PCNA结合上来，并与其它附属蛋白形成关联，使DNA聚合酶A松解，在末端与引物分离，再促使DNA聚合酶D与引物连接，这样进入了DNA合成阶段[26]。PCNA在增殖细胞周期中的含量变化与DNA复制的时相变化均具有明显的周期一致性, 高水平的表达提示增殖活跃。Bolton等[25]在PCNA在细胞周期中表达情况的研究发现，PCNA是正常细胞转变为肿瘤从而进入增殖失控状态的标志性蛋白因子，绝大多数细胞在G0-G1期没有观察到PCNA的明显表达，肿瘤细胞在G1末期开始显现出与正常细胞不同，PCNA的表达迅猛增加，在S期达到顶峰，从G2期开始表达逐渐下降，M期几乎观察不到PCNA的明显表达。这种变化是与DNA复制紧密关联的。

PCNA蛋白的表达程度直观的反映了细胞的增殖活跃程度，PCNA含增高时，肿瘤细胞复制间期缩短，并且分化程度低，包括胃癌、肝癌和肺癌等恶性肿瘤的研究结果中均提示类似规律。PCNA发挥作用的详细机制还不清楚，Koundrioukoff等[27]研究发现，PCNA作为一种细胞周期调节蛋白体现了细胞增殖状态，发挥作用主要是在S期，细胞进入S期后，核内会表达众多与复制相关的蛋白因子，CDK2在核内底物水平磷酸化中起重要作用，但需要与PCNA连接后才被激活，PCNA促使CDK2对底物的磷酸化作用，为DNA复制供能，证明了PCNA与肿瘤增殖活动紧密联系。康元上等[28]认为，随着膀胱肿瘤分级、分期的升高而增强，各级别间肿瘤细胞着色阳性率差异显著，PCNA阳性表达在肌层浸润性膀胱肿瘤显著高于非浸润性肿瘤组织，并且复发组也明显高于初发组，如果发现PCNA 阳性率明显增高，肿瘤很可能已进展为浸润性癌，易复发，需密切随访。PCNA的免疫组织化学染色是确定肿瘤细胞处于增殖周期良好的客观指标。

5 端粒酶(TLMA)

在细胞周期性增殖过程中，作为染色体短臂的端粒不能保持完整，当细胞DNA因端粒严重缺失而序列混乱时，细胞无法继续复制而死亡，但端粒酶的存在能以自身RNA为模板，合成端粒DNA，并结合到染色体端粒缺损处，使端粒末端延长，从而延长细胞的寿命。端粒酶参与了细胞凋亡的调控，正常组织中端粒酶表达水平很低，肿瘤细胞中多为阳性表达。端粒酶作为可能的导致膀胱肿瘤的原因受到关注。Cassel等[29]以端粒酶活性作瘤标对膀胱移行细胞癌患者随访研究发现，肿瘤组织的端粒酶阳性率与癌旁正常组织差异明显。端粒酶活性测定已通过体外扩增端粒酶(TRAP)法或应用RT-PCR测定端粒酶亚单位法开始用于膀胱肿瘤标记物的研究。TRAP法应用较多，可从至少10个细胞中快速检测到端粒酶活性，从而使端粒酶活性检测在膀胱肿瘤的诊断及随访中应用成为可能。Erdem等[30]用TRAP法对比端粒酶在膀胱癌患者与健康志愿者的尿液中的活性，总的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为77.4%、93.5%、82.7%、91.1%,并认为检测稳定性尚不理想是未临床推广的原因。也有学者报道[31]，端粒酶检测膀胱癌的结果并不完全可信，在泌尿系存在结石、炎症或BPH患者，该方法假阳性率高达23.3%，临床应用应谨慎。但端粒酶作为还未商品化的肿瘤标记物具有广阔的前景。

6 其它

目前，用于临床膀胱癌检测的肿瘤标记物还有很多，如Survivin、E-钙黏素(E-cad)、HAase、BTA、UBC、FN、L-selectin、MCM5、P27、MSI、FB/FDP、BGA、integrin、centrosome等，有的报道取得了较好效果，它们对有膀胱刺激征和血尿的患者筛查及监测肿瘤复发有积极作用，但由于观察时间短，缺乏循证医学支持，作为临床诊断的手段还有待进一步研究，尚未在临床上广泛推广应用。

7 问题与展望

膀胱肿瘤是多基因参与、多分子协调、多阶段的复杂疾病，究竟是哪些因素在其发生、发展及复发的过程中起主导作用，以及这些作用的具体机制尚不完全清楚，膀胱肿瘤诊断金标准依然是膀胱镜活检，对肿瘤标记物的研究为膀胱肿瘤早期诊断和术后监测带来希望。多基因、多蛋白共同推进膀胱肿瘤发生机制的深入研究，为分子靶向治疗提供了新思路，分子生物学标记物也有了广阔的发展前景，P53、PCNA、VEGF等肿瘤标志物已经在临床上应用，很多其它肿瘤标记也处于评估阶段，几种肿瘤标志物的合理联合检测可能将成为诊断及监测膀胱肿瘤复发的有效手段。

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