AQP9在脑疾病中的研究进展＊

邵宝平，余华晟，王建林

（兰州大学生命科学学院 动物学研究所，甘肃兰州 730000）

水可以调节生物体细胞内外环境的平衡，是生命中不可缺少的物质。所有组织细胞都可以通过简单扩散的方式让水通过，但同时发现有些细胞如红细胞、肾的近曲小管上皮细胞对水的通透性较其他组织细胞更高。这一现象提示，水的转运不仅靠顺浓度梯度扩散，或许存在着未知的主动转运过程，早在19世纪中期便有研究者提出在某些组织细胞膜上或存在着某种功能性主动水转运通道的假说。目前研究发现，水是活细胞中参与生化过程的重要分子，它可以通过细胞质膜中水通道蛋白（aquaporins，AQPs）迅速扩散，这类通道蛋白家族分布广泛，至少有150种水通道蛋白在微生物、无脊椎动物、非哺乳类脊椎动物、植物中被描述。从被发现至今，水通道蛋白家族成员的数量一直在增加，目前已有13种在哺乳动物的不同组织中表达。

最近，有研究表明，水通道蛋白具有广泛的通透性，其包括气体（CO2和NO）和其他小分子溶质（如甘油、尿素等），这些分子可以透过细胞膜上水通道蛋白迅速扩散。目前，水通道蛋白家族根据其序列同源性和通透性划分为水通道蛋白、水甘油通道蛋白以及超水通道蛋白。AQPs的发现对生物有机体内物质跨膜转运和细胞内外环境平衡调节机制的研究及临床代谢类障碍疾病病理的发现、认识和治疗，具有划时代的意义。

1 水通道蛋白家族的分类

水通道蛋白家族成员有着相同的结构，即6个跨膜的α螺旋，且羧基C端和羧基N端均在胞内，分子质量约为30ku。其共同的特征是均具有相同的序列片段（Asn－Pro－Ala，NPA）缠绕折叠形成水孔。根据以上描述，水通道蛋白家族被分为3个亚类［1］。

1.1 水通道蛋白亚类

由 AQP0、1、2、4、6和8组成，这一亚类只对水有通透性。其中AQP6和AQP8属于这一亚类是基于它们的序列特征，但是AQP6可透过阴离子，而AQP8可透过尿素。该特例充分说明将水通道蛋白家族分为3个亚类的困难。

1.2 水甘油通道蛋白亚类

包括AQP3、7、9和10，不仅可以透过水，而且可透过甘油、尿素及一些单羧酸。水甘油通道蛋白成员之一的 AQP9，其呈现出与 AQP3（48%）和AQP7（45%）的高同源性，而且在氨基酸残基20～281，AQP9与AQP7有76%的同源性，AQP9与其他水通道蛋白同源性相对较低，包括属于水通道蛋白AQP1，仅有33%的同源性，其中有趣的是，AQP9拥有3个氨基酸残基较前于AQP1的第2个NPA序列的cystein 213，其cystein可能具有AQP1中对水银抑制（敏感）的功能［2］。

1.3 超水通道蛋白亚类

包括AQP11和12，它们存在于细胞质中，其通透性还未研究清楚。超水通道蛋白可能参与细胞内的水运输、细胞器体积和内囊体水平衡的调节。

2 AQP9在哺乳动物中的定位及脑部的表达及功能

2.1 AQP9在哺乳动物中的定位

AQP9存在于哺乳动物部分器官的某些细胞中，比如血液白细胞、睾丸、肝脏及大脑，而且有研究表明在哺乳动物胎膜中也有大量表达。在肝脏中，高度表达的AQP9在肝细胞质膜上是通过其自身的极化来应对大量的血窦［3］。而且，在肝细胞中，AQP9扮演着甘油通道的角色，在禁食期间，甘油参与了肝细胞的葡糖异生作用，且研究表明，在禁食4d后，AQP9表达量大幅提高，重新喂食，AQP9的表达将恢复到正常水平［4］。最近，通过AQP9基因敲除小鼠的进一步研究证实该蛋白参与肝细胞甘油的代谢，并显示其比野生型小鼠血液中有更高的甘油浓度，其中，AQP9基因敲除干扰了正常甘油的代谢，但野生型小鼠和AQP9基因敲除小鼠在持续的禁食试验中有着相同的反应［5］。该研究结果表明在其他组织（如肾皮质、肠及脂肪组织）中可能存在着水甘油通道蛋白表达的补偿机理。AQP9在细胞中清除尿素的作用，也可认为是因为肝脏中产生了大量的尿素，而没有尿素转运蛋白的表达，由于AQP9对尿素具有通透性，它可能促进尿素从肝脏到血液的清除。

2.2 AQP9在脑中的表达

最初，AQP9在哺乳动物脑中的表达，在其水通道蛋白研究领域存在激烈的争议。关于“AQP9在脑中的表达：是神话还是事实？”的争论首先由Rojek A M 等［5］发起，在其报道中，该研究团队声明AQP9非特异性标记在AQP9基因敲除小鼠和野生型小鼠脑中均被发现。该结果与以前论文中通过免疫印迹研究表明AQP9mRNA存在于星型胶质细胞及证实AQP9mRNA在大鼠脑内表达的结果相反。

但是，到目前为止，AQP9在若干哺乳动物脑、脊髓及视网膜星型胶质细胞、神经元以及软膜下血管的内皮细胞中的确是表达的。AQP9表达的神经元绝大部分是儿茶酚胺神经元，在大鼠和小鼠中这些神经元以表达酪氨酸羟化酶为特征［6］，且在儿茶酚胺神经元中免疫组化产物的分布与该区域AQP9 mRNA的分布存在着较强的相关性。最近，通过原位杂交研究表明AQP9mRNA在神经系统细胞中的表达部位与AQP9免疫反应产物分布的位置相同［7］。该研究表明，小鼠脑中AQP9mRNA的含量显著低于大鼠的，这可以解释Rojek AM等的研究结果与先前相关论文报道存在差异的原因。研究报道表明，AQP9不仅在啮齿类动物脑星形胶质细胞、儿茶酚胺神经元及脊髓均中有表达［8］，而且在灵长类脑皮质部分区域确有较高表达［9］。

但是，迄今为止，AQP9在脑中的功能依然是推测性的。然而，AQP9的分布表明AQP9仅仅只是维持水平衡的通道的观点应该被修正，事实上，儿茶酚胺神经元中AQP9的表达并不能直接说明其参与系统渗透压的调节。儿茶酚胺神经元与其他神经元如神经肽Y等其他类型神经元相连接参与动物体能量代谢的调节。事实上，儿茶酚胺神经元的电位活动在甘油和乳酸浓度上升时被改变，包括摄食行为的最终改变。由此推测，在脑中AQP9作为代谢通道参与了能量代谢。而且，2010年Marina Zelenina的最新研究报道进一步证明了此观点［10］。

AQP9的存在可能促进甘油和单羧酸盐的扩散，AQP9为神经元的能量代谢提供了底物。并且，已证实AQP9在多巴胺神经元和星型胶状细胞的线粒体中也存在。有趣的是，在该研究中表明AQP9在脑细胞中有2种亚型存在，其小亚型（26ku）存在于线粒体内膜中，而大亚型（30ku）存在于细胞膜中。

2.3 AQP9在脑中的功能

从AQP9的别名“神经元通道”可以看出，作为水甘油通道蛋白家族的AQP9具有广泛的通透性特征。的确如此，通透性试验表明AQP9不仅对水具有通透性，而且对尿素、甘油、甘露醇及山梨糖醇也具有通透性；另外，AQP9可以透过嘌呤（腺嘌呤）、嘧啶（尿嘧啶和化学疗法中使用的氟尿嘧啶）及一元羧酸（乳酸和β羟基丁酸［2］；有研究表明，氨也可以透过AQP9，但是，其环形糖、核苷、谷氨酸盐及甘氨酸不能透过AQP9［2］。有趣的是，AQP9对一元羧酸，比如乳酸和β羟基丁酸的通透效率取决于pH，尤其在pH为5.5时通透性急剧增加［2］，其表明单羧酸盐只有在质子化时才能通过AQP9。AQP9还可以促进类金属材料的运输，这表明AQP9可能是哺乳动物细胞摄取亚砷酸盐的主要途径［12］。进一步研究表明，缺血再灌注早期AQP9表达升高为保护性作用，后期表达下降可能与再灌注血液供应以及能量代谢恢复有关［11］。AQP9对甘油和乳酸的通透性强烈表明，该通道不仅参与水的运输与平衡，而且其对代谢物的通透性提示它在能量代谢中可能也发挥着作用。

3 在脑及脑神经疾病中的水甘油通道蛋白与水通道蛋白

3.1 在脑血管疾病中的水通道蛋白

在啮齿类动物脑中，水通道蛋白作为水的通道在细胞内外水的动态平衡中扮演着重要角色，因而，其可能参与了神经活动的正常维持。在脑局部缺血中可以观察到脑环境的较大扰动，通常会引发局部脑水肿。脑水肿是颅脑创伤后最常见也是最严重的继发性损伤，其病理改变是过多的水分积聚在脑细胞内或细胞外间隙，引起脑体积增大、重量增加、颅内压增高、脑疝甚至死亡。一般认为，水通道蛋白参与局部缺血后脑水肿形成和消退过程中水的转运。目前，研究表明在哺乳动物脑中主要表达了AQP1、AQP4和AQP9 3种水通道蛋白，然而，水肿过程中上述各蛋白的作用又是什么呢？近年来的研究表明，在脑水肿脑细胞膜内外水、电解质的分布失衡的过程中水的转运存在着一种由水通道蛋白介导的主动运输和快速调节过程［13］。为了探讨这一问题，有研究报道，在瞬时的中风模型中，没有观察到AQP1表达的变化，这提示AQP1在脑水肿的形成中并不扮演关键角色。然而，AQP4的表达在中风后1h和8h达到2个峰值，其与脑半球最大的两个肿胀峰值的时间相同，其中有趣的是，AQP4表达的调节十分迅速，中风1h后，在星型胶质细胞终足中AQP4就被诱导表达。最近，用一个预处理模型诱导AQP4的表达，发现其能促进水的清除从而防止脑水肿的形成。与上述结果相结合表明，AQP4的早期诱导表达将阻止脑水肿的形成［14］。因此，对水通道蛋白在脑水肿发病中的作用研究较多的是AQP4及AQP9。

3.2 在脑血管疾病中的AQP9

在啮齿类动物模型中，AQP9的表达受脑局部缺血的影响。研究发现，在小鼠瞬间的中脑动脉梗塞后，在梗塞边缘活跃的星型胶质细胞中AQP9的表达量上调［3］；与 AQP4相比较，AQP9在24h内的诱导表达量显著地随时间的延伸逐渐上升，但与肿胀程度不相关。脑出血早期AQP9表达降低可延迟细胞内水肿的形成，而脑出血后期AQP9表达上调［15］；脑缺血后AQP9表达增强，血脑屏障通透性增加［16］；在大鼠脑中，缺氧引起AQP9的表达上调，而复氧使其表达明显下降［17］；轻度脑外伤早期和继发性损伤期AQP9表达的上调，其可能分别与轻度脑外伤应激和能量代谢调节有关［18］。因此，AQP9的表达上调可能是脑水肿的一个重要致病环节；进一步研究表明，AQP9与脑水肿的形成密切相关［19］，并且，AQP9与水电解质平衡调节和能量代谢调节有关［20］。

在中风晚期，AQP9的上调表达也见于没有被中脑动脉区影响的边界区域，比如海马。在沙土鼠（Gerbils）全脑缺血模型中，进行了AQP9相似时间点的表达研究，其与局部脑缺血的研究结果相比较，在缺血后6h后海马CA1区锥形神经元中AQP9被诱导表达，在12h后海马CA2和CA3区锥形神经元中AQP9才被诱导表达［21］，其中有趣的是代谢应激后，AQP9在锥形神经元中被诱导表达，但该蛋白在生理条件下却不表达，正如在AQP4中发现的那样，AQP9的表达变化也取决于试验模型的不同而不同。在全脑缺血后4d～5d，AQP9的表达也见于星型胶质细胞中，这与瞬时的脑局部缺血的观察结果相同［3］。有趣的是，能量代谢障碍（葡萄糖和氧气浓度的下降）影响AQP9的表达。至今，AQP9在神经元和神经胶质细胞中表达量增加的功能性研究结果还没有被阐明，但是，AQP9对水、甘油、乳酸的通透性在病理情况下如脑缺血中可能是很重要的。有趣的是，在pH降低到5.5时，AQP9对乳酸的通透性增加4倍［2］。在脑局部缺血后，乳酸中毒可能会增加AQP9对乳酸的通透性，因此，可以通过星型胶质细胞摄取过多的乳酸。通过这种方式，AQP9可以在脑局部缺血中帮助乳酸和甘油从细胞外清除。在再灌注后的时间中，AQP9可能促进乳酸在星型胶质细胞和神经元之间的运动，作为能量代谢的底物，其表明在局部缺血后AQP9可帮助神经元的修复。

3.3 在糖尿病中的AQP9

对肝脏和大脑的研究结果显示，AQP9参与能量代谢。首先，在启动子区负胰岛素应答元件参与AQP9蛋白的水平（表达量）的调节，因此，胰岛素浓度的升高将减少肝细胞中AQP9mRNA和蛋白质的表达；其次，在禁食期间，脑中AQP9表达量会增加，重新喂食后，其AQP9的表达量又回到基础水平［4］。在糖尿病模型和胰岛素抗药性小鼠模型中，链脲霉素的注射会诱导AQP9的表达量急剧上升。从肝脏中获得的结果来看，可以提出下面的假设：血浆中低浓度的胰岛素促进脂肪细胞中甘油的释放和肝细胞对甘油的摄取，这两个试验中，低浓度胰岛素诱导AQP9在肝细胞中的表达均将促进甘油从血液中的吸收。

在外周神经和中枢神经系统中，均发现AQP9与能量平衡的调节相关。在进食状态下，血液胰岛素浓度代表且也可以影响大脑中葡萄糖的敏感区域。有趣的是，在进食状态下，AQP9阳性神经元存在于或涉及大脑葡萄糖敏感区域［6］。全身性的胰岛素已被报道能穿过血脑屏障，而且胰岛素效应器在儿茶酚胺神经元中表达。在糖尿病大鼠模型中用链脲霉素注射诱导处理后，AQP9含量的增加仅出现在儿茶酚胺神经元核中，在顶叶皮质和小脑中却未出现［22］。因此，与AQP9在肝脏中表达一样，脑中AQP9的表达受血液中胰岛素浓度的控制。这个结果支持了这样的假说，神经元中的AQP9作为甘油－乳酸通道扮演着能量平衡的角色，但这需要更多的功能证实。

3.4 在脑肿瘤中的AQP9

与非肿瘤组织相比，人和大鼠神经胶质瘤中AQP9的表达量增加。大鼠神经胶质瘤周围AQP9的强着色，不同于人的从整个神经胶质瘤及其边缘皮质神经元染色的逐渐加深［23］。有趣的是，AQP9为甘露醇和甘油的转运通道，在临床上应用两种复合物增加渗透压治疗来减缓肿瘤中脑水肿的形成。在人类癌旁组织中，可以观察到AQP9表达量的增加，正如在全脑缺血后海马椎体神经元中看到的一样。这暗示能量代谢的扰动可能诱导神经元中AQP9的过量表达，但这一表达量增加的功能性结果还不清楚。

3.5 在其他脑及脑神经疾病中的AQP9

在脑和脊髓的损伤、多发性硬化、癫痫等脑部其它疾病中，水通道蛋白的表达和功能已被研究。但是，至今，AQP9在这些疾病中的表达完全不清楚。AQP9基因敲除小鼠的存在将帮助了解AQP9在这些疾病中的可能作用。

正如前面所提到的，AQP9在儿茶酚胺神经元中的高表达以及对代谢应激的敏感、能量代谢和进食状况是神经性病变的敏感因素及黑质中胰岛素受体的缺少也见于帕金森疾病中之外，在其他脑及脑神经疾病中的研究主要如下：AQP9对亚砷酸盐［11］的通透性会被金属汞抑制，而且其通透性可能会受其他金属影响；砷将诱导多巴胺能神经元的应激和大鼠运动行为逐渐降低；金属污染的环境是有毒的，会导致帕金森综合症，因其胰岛素受体的减少可能导致AQP9在儿茶酚胺神经元中的表达增加，与水中的亚砷酸盐相结合，可能导致多巴胺能神经元的应激和长期的神经元死亡。由此推测，神经元中AQP9可能参与帕金森疾病的病理生理过程，其可能成为了解此疾病源头的有效方法。

4 AQP9表达调节的分子机理

至今，AQP9表达调节的分子信号通路在体内还没有被报道。然而，有一些研究团队已对AQP4和AQP9在星型胶质细胞培养中的表达调节进行了研究，并已确定在一些水通道蛋白表达的调节通路包括蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）途径。无需蛋白质合成的PKC途径的激活也将下调AQP9mRNA和蛋白质的表达量，尽管在AQP9中存在能被PKC磷酸化的序列，但还没有观察到通过直接磷酸化调节此蛋白的表达［24］。与AQP4相比较，丁酰环磷酸腺苷通过对PKA的激活进而诱导星型胶质细胞中AQP9mRNA和蛋白质的表达减少，在渗透性应激后，P38MAP激酶与AQP4和AQP9表达量的升高相关［25］。在局部缺血中MAP激酶通路被激活，而且此通路将参与其梗塞周围星型胶质细胞AQP9表达的增加。在小鼠脑瞬时局部缺血中，MAP激酶通路可能调节了星型胶质细胞AQP9的过表达［26］。

5 结语

综上所述，AQP9在脑中表达，且参与了相关脑疾病病理的调节；近来的研究，AQP9参与脑中水平衡的作用需要被重新考虑；AQP9的表达水平取决于胰岛素浓度，这一现象支持了AQP9参与脑部能量代谢的观点；在脑局部缺血中，AQP9的表达随时间而被诱导，AQP9还可能参与中风后过多甘油和乳酸的重新摄取。但是，AQP9在相关脑疾病中的调节机理还需进一步完善，而其在体内相关脑疾病中表达调节的分子信号通路尚待进一步研究。

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