分子生物学技术在布鲁菌种型鉴定上的应用＊

许邹亮，南文龙，陈义平＊

（1.中国动物卫生与流行病学中心诊断液研究室，山东青岛 266032；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌（Brucella）引起的人畜共患病。全球范围内有170多个国家和地区有人、畜布鲁菌病存在和流行，给畜牧业造成重大损失，给人类健康造成严重危害［1－2］。布鲁菌为革兰阴性球杆菌，传统分类鉴定方法将布鲁菌属分为6个种19个生物型，包括羊种布鲁菌（B.melitensis，也称马尔他布鲁菌）1、2、3型，牛种布鲁菌（B.abortus，也称流产布鲁菌）1、2、3、4、5、6、7、9型，猪种布鲁菌（B.suis）1、2、3、4、5型，犬种布鲁菌（B.canis）、绵羊附睾种布鲁菌（B.ovis）和沙林鼠种布鲁菌（B.neotomae）各有1个生物型。后来，欧美学者又从海洋哺乳动物体内分离到不同于上述布鲁菌种的布鲁菌菌株，暂时定名为海洋种布鲁菌（B.maris），有人建议将其划分为鲸种布鲁菌（B.ceti）和鳍种布鲁菌（B.pinnipedialis），但尚未形成统一意见［3］。传统分类方法往往操作比较繁琐，鉴定周期长，需要特定的实验室条件，并且对于一些非典型菌株难以进行鉴定。分子生物学技术的快速发展为细菌分类鉴定提供了新途径，并使细菌分类鉴定工作从一般表型鉴定深入到基因型鉴定。分子生物学方法应用于细菌种型鉴定可在一定程度上克服传统分型方法的缺陷，具有简便快速、结果判定敏感、稳定可靠、重复性好等优势［4－5］。

近年来，分子生物学技术应用于布鲁菌种型鉴定取得了较大进展，主要包括多重PCR、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、重复性基因外回文序列（repetitive extragenic palindromic，REP）、多位点可变数目串联重复序列分析（multiple locus variable number tandem repeats analysis，MLVA）和荧光定量PCR（real－time PCR）等。

1 多重PCR

Bricker B J等［6］于1994年根据保守重复基因序列IS711在布鲁菌不同种型间存在的数目和位置的不同，建立了AMOS－PCR方法，该方法通过扩增带的大小能够区分B.abortus1、2、4 型，B.melitensis1、2、3型，B.suis1型和B.ovis。对美国107株野外分离菌株进行检测，并与传统方法鉴定结果比较，其符合率达100%。1995年，Bricker B J等［7］又对该方法进行了改进，使之能够鉴别疫苗株S19和RB51，另外，B.canis也由此而得到鉴别，消除了分类中的假阴性。之后数年，各国学者又相继建立和完善了若干套布鲁菌种型鉴定的多重PCR方法，应用这些方法可以完成绝大多数布鲁菌种型的鉴定以及疫苗与分离株的区分［8－10］。相比较而，言AMOS－PCR方法仍是应用较多且被公认的一种布鲁菌种型鉴定的方法。

2 限制性片段长度多态性和扩增片段长度多态性

限制性片段长度多态性（RFLP）和扩增片段长度多态性（AFLP）方法用于布鲁菌种型的区分也多见报道。Cloeckaert A 等［11］通过PCR－RFLP方法对77株布鲁菌标准株和野毒株进行鉴定，用9种限制性内切酶处理Omp25基因，结果显示所有B.melitensis毒株都缺少EcoRV酶切位点，B.ovis毒株在该基因的3′末端缺失了50个碱基。另外用13种限制性内切酶分析Omp2a和Omp2b基因，结果比Omp25基因呈现出更丰富的多态性，除了B.canis与B.suis3型和4型无法区分外，6种经典布鲁菌和它们的一些型都能得到鉴别。Cloeckaert A等［12］又基于疫苗株Rev.1的rpsL基因有单碱基突变，用NciⅠ酶切该基因，从而将疫苗株Rev.1与其他布鲁菌标准株和分离株区分开。

Whatmore A M等［13］用几种不同的限制性内切酶和选择性引物进行AFLP分析，该方法可将B.ovis、B.melitensis、B.abortus、B.neotomae和B.maris野毒株区分开，但B.canis和B.suis不能进行有效区分。骆利敏等［14］采用AFLP技术将布鲁菌基因组DNA经EcoRI／MseI酶切并与相应的人工接头连接后，使用选择性引物进行PCR，成功构建了多态性丰富、重复性好的布鲁菌DNA指纹图谱。

3 随机扩增多态性DNA

随机扩增多态性DNA（RAPD）是一种DNA指纹多态性分析技术，又称随意引物PCR（AP－PCR）。Fekete A 等［15］采用了5条随机引物 P1、P2、P3、P4和P5对25株不同布鲁菌菌株进行AP－PCR鉴定。单独使用P1和P2可分别产生7和10种多态性条带。P1－258能将疫苗株S19与B.abortus2 308S区分开；P1－258和P1－1172能将B.abortus2 308S与B.melitensis16M 区分开；P1－446能将B.canisRM6／66与 其 他7 株 布 鲁 菌 区 分 开；P1－319，P1－537，P1－1010和 P1－1172能将B.ovisANH3572、B.suis1330和B.neotomaeSE－1169区分开。同样，10种不同的P2多态性条带亦能将不同毒株鉴别开。另外，P3、P4和P5单独使用时分别产生6、6和12种多态性条带，成对使用时多态性条带会略有不同，但是都能将该25株布鲁菌进行有效的区分。Tcherneva E等［16］利用2条10碱基的引物（OPLO4和P5）对46株布鲁菌进行RAPD分析，结果显示B.canis和B.suis1型处在同一个分支上，其他的菌株均可在种的水平上加以区分。

4 重复性基因外回文序列和肠杆菌基因重复一致序列

重复性基因外回文序列和肠杆菌基因重复一致序列（REP－PCR／ERIC－PCR）技术的出现和使用，使得细菌菌株的亲缘关系、多样性等方面的研究变得简易、快速。崔步云等［17］应用REP－PCR以布鲁菌属各种型代表菌株为参考，对国内分离的典型、非典型布鲁菌菌株、疫苗菌株进行分类研究，结果不仅在属的水平上可以检测、鉴定布鲁菌，还将107株国内外布鲁菌的参考菌株和地方流行菌株分为8个组。王家熊等［18］利用REP－PCR技术对从患者体内分离到的3株布鲁菌成功进行了种的鉴定，结果均为羊种，与传统生物学分型结果一致。

5 多位点可变数目串联重复序列分析

多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）也是一个基于PCR技术的分型方法，该方法可区分基因组上多个具有多态性串联重复序列位点（VNTR）的重复数，因此可用来区分菌株的基因型。Bricker B J等［19］首次将MLVA方法用于布鲁菌的分型研究，发现各菌株基因组中的8个位点均含有一段“AGGGCAGT”的短串联重复序列，PCR扩增后计算每个位点的串联重复单元的数目，能够将布鲁菌分离株进行归类区分，并将该方法命名为高变八聚体寡核苷酸指纹（HOOF－Prints）。Whatmore A M等［20］利用21个VNTR位点对121份来源于世界各地的布鲁菌临床分离株进行分型研究，最终把121份菌株分成119个基因型，只有2株B.neotomae65／196和65／197与2株B.melitensisUK21／04和UK26／04出现相同的结果。相关的研究显示，MLVA方法Hunter－Gaston分辨率指数极高，可完成不同源布鲁菌株的鉴别，并确定其独立的基因型［21－22］。

MLVA分型方法因其稳定性好、分辨率高等特点而被国内外学者广泛采用。其优势还表现在可以作为流行病学调查的工具，确定传染源及传播途径，可以找到菌株之间的关联，确定病人或畜是再感染还是复发［23－24］。目前国际上已有用于布鲁菌 MLVA 分型的 数据库 （http：／／minisatellites.u－psud.fr），研究者可以选择不同的VNTR位点对布鲁菌菌株进行鉴定和归类。

6 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Real－time PCR）技术对布鲁菌的分种研究主要包括两种方案，一种是以插入元件IS711为基础的DNA长度多态性为研究对象，另一种是以DNA单核苷酸多态性（SNP）作为分种基础。

6.1 基于IS711的实时荧光定量PCR

Redkar R等［25］在布鲁菌插入序列IS711上设计上游引物，在插入基因邻近的单染色体DNA上设计下游引物和探针，利用该方法对已知菌株和临床分离株进行鉴定，结果所有B.abortus和B.melitensis都能得到有效鉴定，B.suis只能鉴别1型。Hinic V 等［26］利用 普通 PCR 和real－time PCR对18份布鲁菌标准株和47份布鲁菌分离株进行鉴别，结果显示两者都能将6种经典布鲁菌鉴别开，荧光定量PCR的检测极限为10个基因拷贝，可以用于极低细菌含量的临床样本检测。相关研究显示，基于IS711的常规real－time PCR，可以有效进行布鲁菌种水平的鉴定。

6.2 基于SNP的实时荧光定量PCR

单核苷酸多态性（SNP）是最普遍的遗传变异形式，利用实时荧光定量PCR技术可研究基因单个位点的突变，使细菌种型鉴定成为可能。Gopaul K K等［27］利用SNP设计了针对6种经典布鲁菌及B.maris的MGB探针，通过对300多株布鲁菌的鉴定，结果证明该方法能在种的水平上有效区分布鲁菌，检测下限为15个基因组DNA。Gopaul K K等［28］又利用布鲁菌疫苗株基因上的SNP位点设计MGB探针，能将B.abortusS19、RB51 和B.melitensisRev.1等3种疫苗株与分离株进行区分。Winchell J M 等［29］采用 Real－time PCR 结合高溶解曲线，应用7对引物对153份布鲁菌分离株进行鉴定，与传统方法比较，其精确度大于99%，并成功地将B.suis从B.canis种中鉴别出来。

7 小结

目前，real－time PCR和 MLVA技术逐渐成为布鲁菌种型鉴定的主要分子生物学方法。应用realtime PCR技术来进行布鲁菌的分种灵敏度高、耗时少，且提高了检测的可靠性和准确性。但是，目前关于实时荧光定量PCR技术鉴别布鲁菌生物型的检测方法研究尚少。与实时荧光定量PCR方法相比，MLVA分析法更容易实现生物型的鉴别，其分辨率更高，并可方便地实现全球数据共享。RAPD、RFLP及AFLP等种型鉴定方法，虽操作简单、成本低廉，但重复性和稳定性稍差。总之，不同的布鲁菌种型鉴定方法各有其优缺点，实际应用时可根据技术条件、时间、费用等多种因素进行选择。当遇到一些非典型布鲁菌株时，可同时采用两种或两种以上的方法进行鉴定，以达到准确分种分型的目的。

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