表位疫苗研究进展＊

赵 德，乔 翠，张 强，郭建宏，高凤山，＊

（1.大连大学生命科学与技术学院分子免疫学实验室，辽宁大连 116622；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原微生物国家重点实验室 ，甘肃兰州 730046）

人类历史上，疫苗的发展史可以分为3个阶段：古典疫苗时期，即在病原体发现前据反复观察和摸索经验而研制出疫苗的时期，例如英国乡村医生Jenner用牛痘接种到人体上，使人获得免疫能力；传统疫苗时期，即利用病变组织、人工培养的病原微生物制备灭活疫苗和减毒疫苗的时期；基因工程疫苗时期，即采用DNA重组技术生产疫苗的时期。传统疫苗可分为减毒活疫苗和灭活疫苗。传统疫苗最大的优点就是免疫力强、保护性好，减毒活疫苗缺点是存在毒力恢复、散毒或基因重组等潜在的生物危害。

当病原微生物入侵机体，给机体造成伤害的同时，也会引发免疫反应。疫苗免疫的基本原理就是利用既能激起免疫应答反应，又不会造成伤害的生物制剂，使机体获得相应的免疫能力，免疫应答反应并非针对整个外源物质，而仅仅是针对表位，通常是一段多肽。表位疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗，它是利用基因工程手段，体外表达或人工合成病原微生物的抗原表位，将其作为一种疫苗使用［1］。表位又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的化学基团，它是能够与T细胞抗原受体TCR或B细胞抗原受体BCR特异性结合的基本单位，最终激起机体的免疫反应，形成对病原微生物的免疫能力。因此，表位疫苗符合未来疫苗发展的方向。

1 表位筛选

要研制表位疫苗，首先要筛选出需要的表位。表位是一个免疫学概念，因此表位的鉴定可以利用与其相关的免疫反应来实现，T细胞表位利用细胞免疫应答鉴定，B细胞表位利用表位与抗体的特异反应鉴定［2］。

1.1 蛋白质降解法

蛋白质降解法是用一些化学物质或者酶将蛋白质降解成多个多肽片段，然后从降解得到的肽混合物中分离得到目的肽。利用化学降解法已成功从多种蛋白，例如谷蛋白、细胞色素b、珠蛋白、血清蛋白中分离得到抗原表位多肽。酶法主要是用酶水解抗原抗体复合物，其原理是抗原抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水解作用［3］。化学法与水解法确定抗原表位的特异性高，但操作复杂繁琐，只能获得线性表位。

1.2 肽探针扫描技术

根据已知病毒的蛋白基因序列，合成连续重复的重叠多肽，通过与抗体的结合，筛选出阳性片段。这一技术要求明确抗原分子的一级结构，只能检测抗原线性表位。口蹄疫病毒（Foot－and－mouth disease virus，FMDV）细胞表位的确定大多使用此法 。Jerner W等［4］对覆盖FMDV蛋白全长的442段十五肽进行了淋巴细胞功能检测，最终确定了位于VP1上第66～80位氨基酸的一个牛主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）特异的T细胞表位。这种方法的优点是鉴定的T细胞表位较可靠，且能发现一些不符合肽结合基序（motif）的MHC分子结合抗原肽。但这种方法也有其局限性，不但工作量大、费用高，而且重叠之间的表位有可能被忽略，所以不能够鉴定出目的蛋白上所有T细胞表位。

1.3 随机肽库技术

将编码表位多肽的寡聚核苷酸整合到编码噬菌体表面蛋白的基因上，该基因表达后的蛋白中含有目的多肽，展示在噬菌体表面。通过设计出编码不同多肽的寡聚核苷酸可以在噬菌体表面展示多达109以上不同的多肽序列，几乎可以涵盖所有的抗原表位。利用抗原表位可以与抗体进行特异性结合的特性，筛选出目的抗原表位，然后将抗体固定在酶标板上，与肽库噬菌体结合，洗去未结合的噬菌体，经过几轮筛选，就可以得到能够与抗体特异性结合的噬菌体。通过DNA序列分析，得出该噬菌体携带的外源序列，进而得出目的表位的氨基酸序列。

Gazarian K等［5］最近利用噬菌体展示技术，构建了展示7肽至12肽的猪伪狂犬病病毒的噬菌体展示库，最后筛选出一个由10个氨基酸组成的共有基序，免疫C57BL／6小鼠后发现产生了伪狂犬病病毒的血清中和抗体，攻毒试验表明除了2只小鼠外，其余小鼠都能够存活。

1.4 计算机表位预测

计算机表位预测是指通过计算机软件预测B细胞表位或者T细胞表位。在已知抗体蛋白结构的基础上，可以做到既能预测构象表位，又能预测线性表位，并能够用图直观的表示出来。在已知氨基酸序列的基础上，可以利用氨基酸的理化数据特征，预测可能含有表位的区域。此外，也可以在噬菌体展示技术的基础上预测表位。Saha S等［6］采用了一种分类算法，该系统检验了源于Bcipep数据库的700个非冗余B细胞表位和源于Swiss－Prot数据库的700个长度为10个～20个氨基酸的随机选择多肽，准确率接近66%。另外，由于T细胞免疫的过程首先需要MHC分子与抗原表位紧密结合，形成复合体。目前已有多种软件可以根据复合物的三维构象、结合多肽的氨基酸序列等信息预测表位［7］。

2 表位疫苗的载体

由于表位多肽只是一段氨基酸残基，免疫原性较差，且容易被降解，因此在实际使用过程中需要借助一定的载体才能发挥免疫作用。

2.1 脂质载体

脂质分子本身不具备免疫原性，但可以作为载体连接在抗原肽的末端，帮助肽分子被抗原呈递细胞识别，不仅使表位多肽在机体内能够稳定存在而不被降解，而且可以增强免疫应答反应。因此，脂质分子是一种较为理想的表位疫苗载体。

Theradigm－HBV制剂是一种治疗乙肝的表位疫苗，该表位疫苗含有乙肝病毒18～27肽段的CTL（cytotoxic T leukocyte）表位，该表位肽段与脂质分子棕榈酸连接从而组成一种脂质表位疫苗，该疫苗已经在小鼠和人体内试验成功［8］。另外，抗流感病毒和抗艾滋病病毒的脂肽疫苗的研究也取得了一定的成果。

免疫刺激复合物（immunostimulating complex，ISCOM）是20世纪80年代发明的一种脂质体，其主要成分为一种皂角素（Quil A），它可以包裹病原微生物的抗原蛋白或者多肽，在体内缓慢释放并诱导机体产生免疫反应。目前ISCOMs应用较为广泛，吴隼等［9］利用中国仓鼠卵巢细胞表达的重组型乙肝病毒表面抗原制备成免疫刺激复合物型疫苗，为ISCOMs型乙肝疫苗的研制奠定了基础［9］。Pahar B等［10］最近将猿猴感染的HIV的辅助性T细胞表位和CTL表位与ISCOM相连形成免疫原，接种恒河猴后能够诱导机体产生一定水平的抗HIV免疫保护性反应。

2.2 蛋白载体

乙型肝炎病毒（乙肝病毒）的核心蛋白能够允许一定程度的缺失和插入，并且能够将外源序列高密度地暴露在蛋白颗粒表面。2008年，Gregson等报道了将乙肝病毒核心蛋白的78位和79位氨基酸之间插入恶性疟原虫免疫显性B细胞表位［（NANP）3］和一个 HLA（human leukocyte antigen）限制性CD4表位 （NANPNVDPNANP），并在 HBc的149位氨基酸后融合一个通用的T细胞表位（326aa～345aa），制成重组的表位疫苗，在欧洲一些国家临床试验证明该疫苗在所有剂量水平上都是安全的，而且有很好的耐受性。英国Acambis公司研制的针对流感病毒所有A型株的表位疫苗ACAM－FLU－A（TM），以乙肝病毒的核心蛋白氨基端163个氨基酸作为载体来递送流感病毒离子通道蛋白M2的胞外结构域M2e，临床试验证明该疫苗具有很好的耐受性和免疫原性［11］。

热休克蛋白（HSP）也可作为表位疫苗的蛋白载体，在肿瘤免疫中发挥着重要作用，通过分子载体的作用将抗原肽呈递APC表面，激活CD8＋T细胞，达到杀伤肿瘤细胞的目的。HSP根据分子量的不同分为4类，即HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和最小的HSP家族。现在认为，HSP90家族和HSP70家族与外来抗原的摄入及参与MHC－Ⅰ类分子的结合有关。HSP70家族的成员还参与新生肽的折叠，并协助表位肽与TAP（transporter associated with antigen processing）的结合。Ren F等［12］将 HSP与人乳头瘤病毒 HPB－16E7的CTL表位多肽偶联，并以腺病毒作为多肽DNA的载体，形成的DNA疫苗能够很好地清除动物模型中的肿瘤细胞，并可诱导CTL细胞的活化。另外，卵清蛋白（OVA）、牛血清蛋白 （BSA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）等也可作为表位疫苗的蛋白载体。肖志军等［13］将传染性法氏囊病病毒VP2蛋白线性B细胞抗原表位肽PJ14和PJ15与OVA偶联免疫小鼠，结果显示，免疫小鼠产生了PJ14和PJ15抗体，持续期达21周。宋幸辉等［14］将传染性法氏囊病病毒VP2蛋白线性B细胞抗原表位肽P22与牛血清蛋白（BSA）偶联，并得到了相应的抗原，临床试验证明具有一定的免疫保护作用。朱彦彩等［15］采用DEC一步法将His6多肽与KLH偶联，制备人工结合抗原免疫小鼠，成功制备了His6免疫原。

2.3 佐剂

为了加强多肽疫苗的免疫效果，有时候使用佐剂作为一种载体与多肽疫苗一起进行免疫。目前最常用的是弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。弗氏佐剂是一种经典的免疫佐剂，分为完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂。Siegel C T等［15］将ras突变体多肽加完全弗氏佐剂免疫小鼠，发现10d内小鼠T细胞活化，14d内出现针对该多肽的迟发型超敏反应。石统东等［16］合成了基于免疫优势性 HbcAg CTL表位、PreS2B细胞表位和破伤风类毒素通用Th表位的多肽，经弗氏佐剂乳化后免疫小鼠，经检测小鼠产生了特异性抗体。

氢氧化铝可以吸附表位多肽，也可作为一种载体用在表位疫苗的研制上。Hariharan K等［17］用氢氧化铝或铝盐作为HPV－16E7多肽疫苗的佐剂免疫C3H小鼠，用HOPE2肿瘤细胞攻击小鼠，发现用氢氧化铝化铝盐佐剂较PROVAXTM佐剂更能明显抑制肿瘤细胞的生长。而Ghochikyan等的研究发现，将老年痴呆症病毒的辅助性T细胞表位2（Th2）的佐剂由氢氧化铝换为Quil A后，免疫后产生的抗体要高于只使用氢氧化铝佐剂乳化表位疫苗。可见，目前对于氢氧化铝佐剂在表位疫苗方面的的应用效果还不是十分明了。

3 表位疫苗的优化

在实际的应用中，为增强表位疫苗的免疫活性，还需要采用各种方式对表位疫苗进行优化。

3.1 抗原表位线性串联

抗原表位线性串联是指采用人工合成的方法将多个不同的抗原表位串联起来，构建具有多种表位肽的复合多价表位疫苗，该方法可以有效增强抗原表位多肽的免疫原性，同时也能够避免载体的引入可能造成的不确定影响。吴绍强等［18］利用分子生物学软件分析了FMDV结构蛋白VP1～VP3上可能的抗原表位，并人工合成了8条表位多肽。通过采用SATⅡ型FMDV阳性血清进行ELISA反应，检测其反应原性，然后通过采用与载体蛋白偶联的合成肽免疫接种小鼠，测定小鼠血清中抗体效价，检测合成肽的免疫原性。结果表明，合成的8条多肽均能与SATⅡ型FMDV阳性血清结合，其中的6条多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体。研究发现，当表位串联时一般要串联30个以上的氨基酸才具有较好的免疫原性［19］。

3.2 MAP空间模式

多价抗原肽（multiple antigen peptide，MAP）是将病原微生物蛋白表面的多种B细胞或T细胞表位的氨基酸连接于树枝状的多聚赖氨酸结构上，构建一种立体结构的多价表位疫苗，这种方式链接的表位多肽可以具有较好的方向性，但是赖氨酸骨架的化学合成成本较高。Joshi M B等［20］将疟疾的多个T细胞以及B表位多肽连接到寡聚氨基酸丛状结构上，构建MAP抗原，免疫小鼠，结果显示其具有一定的免疫活性。

3.3 表位修饰

在表位串联时可能会在连接处产生新的表位，从而影响原表位的免疫活性。娄加陶把结核杆菌抗原 Rv0309、Rv0173的 HLA－A－＊0201限制性CD8＋CTL表位与其他已知抗原表位优化组合，并引入PADRE及“木马肽”序列，采用furin肽酶识别基序RVKR作为接头，构建并重组表达、纯化“串珠式”表位肽疫苗，并在细胞水平上对其免疫原性进行分析。结果表明，重组表达的“串珠式”表位肽在细胞水平上能诱导出更强的CTL保护性应答反应［21］。石统东等研究发现，设计HBV治疗性表位多肽疫苗时，在CTL表位的基础上引入“Th＋B”细胞表位以及3个丙氨酸的间隔序列，可以争强CTL表位肽的免疫原性［22］。虽然MHC分子与表位的结合是特异性的，但这种特异性不是指只能与单一的肽段结合，而是指可以识别一系列具有某些共同特性的肽段，其中包括一些经过修饰的非天然肽段，即修饰的肽配体（altered peptide ligand，APL）。通过对肽分子进行修饰，在特定的位置替换成与 MHC有较高亲和力的氨基酸，有利于表位肽与MHC分子的结合。唐艳将黑色素瘤相关抗原 MART1／MelanA（27～35）（AAGIGILTV）表位的P1位由L替换为A，提高了表位的免疫原性［23］。

4 表位疫苗的使用现状

与传统疫苗相比，表位疫苗有着明显的优势，目前，表位疫苗在肿瘤以及病毒性疾病的预防方面已经有了较广泛的应用，同时在细菌、寄生虫等引起的疾病的防治中也取得了一定的进展。

4.1 肿瘤多肽疫苗

肿瘤多肽表位疫苗是来自肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因或癌基因突变蛋白的多肽组成的疫苗。Powell D J等［24］用相关多肽皮下注射5位黑色素瘤患者，经过1年的治疗，患者循环系统中相应的细胞毒性T细胞从4.8%上升至35.1%，并出现了记忆T细胞。Letsch A等［25］运用表位疫苗治疗9名至少经过3次黑色素瘤切除后又复发的患者，并进行长期随访，观察发现治疗效果明显，该研究小组因此认为应用多肽疫苗可延长恶性黑色素瘤复发时间间隔。

4.2 病毒表位疫苗

20世纪80年代，Strohmaier K等［26］发现FMDV含有能引起细胞免疫应答的特殊氨基酸位点，即病毒表位，从而开始了病毒表位疫苗的研究。目前，HIV以及丙型肝炎病毒等相关的表位疫苗也进入临床试验。Kran A M 等［27］使用 Vacc－4x肽疫苗，免疫40位HIV阳性患者，无任何不良反应。同时，体外诱导T细胞增殖试验，结果产生明显的免疫应答反应。Chua B Y等［28］通过CD4＋T细胞辅助表位合成一种脂肽，能诱导产生有效的CD8＋T细胞应答，清除患者体内的HCV病毒。

4.3 细菌表位疫苗

表位疫苗在抗菌方面的应用也较为广泛。Chen J G等［29］构建了铜绿假单胞菌多表位MyD88基因疫苗，成功地刺激小鼠产生高度特异性的抗体，气管接种该疫苗的小鼠肺匀浆细菌计数明显低于对照组。另外，周维英等［30］构建了幽门螺旋杆菌黏附素和尿素酶B亚单位双亚基多表位疫苗，免疫检测有较好的免疫原性。

4.4 寄生虫表位疫苗

抗寄生虫的表位疫苗相对较少，目前仅有少数寄生虫表位疫苗的使用。贾逵等将弓形虫新基因wx2中的2个编码表位的片段w2a和w2b构建到重组质粒中，制成表位基因疫苗免疫小鼠，获得了较好的效果［31］。另外，对抗日本血吸虫病表位疫苗的研究也取得了一定进展。

5 问题和展望

目前，表位疫苗的应用仍面临许多亟待解决的问题。例如，表位的作用机制尚不完全清楚；表位多肽分子较小，免疫原性较弱，而佐剂的使用一定程度上会增加表位疫苗的副作用；多肽合成以及纯化技术的局限性也增加了表位疫苗的使用风险。另外，笔者认为表位研究的不均衡也是目前表位疫苗研究中存在的一个主要问题，尤其对于动物病毒。譬如，对于FMDV，此前的表位研究主要集中于B细胞表位和Th细胞表位，而缺乏对CTL细胞表位的研究，导致表位疫苗中表位的组成缺乏必要的CTL表位。目前，笔者所在课题组正在筛选FMDV的CTL表位，为今后开发和研制FMDV的CTL表位奠定基础。

总之，在今后的表位疫苗研制过程中，还有许多方面亟待完善，因此需要从事表位研究的科研工作者坚持不懈的努力。

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