RNAi基因沉默的动力学研究进展＊

孟 霞，鲁秦安，唐彩琰，陈树林＊，张文华

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.西安文理学院，陕西西安 710065）

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中，由高度保守的双链RNA（double－stranded RNA，dsRNA）诱导同源mRNA高效特异性降解的现象［1］。它是生物体抵御外来感染的一种重要保护机制，为此RNAi被《Science》杂志评为2001年十大科技突破之一，名列2002年十大科学之首。2002年Nature杂志亦将RNAi评为年度重大科技成果之一。现已证明RNAi现象广泛存在于大多数真核生物中。dsRNA作为细胞内源性基因表达调节物，具有低毒性和高特异性等特点，且具有很强的基因沉默效率。dsRNA与靶基因有序列同源性，长双链RNA被导入或转染至细胞内时，会被Dicer酶（dsRNA specific endonuclease，Dicer）裂解成短小干扰 RNA（short－interfering RNA，siRNA），然后被结合到诱导沉默复合体RISC（RNA－induced silencing complex，RISC）上，引导 Ago2蛋白（slicing protein Argonatue 2）裂解靶基因 mRNA［2］。RNA干扰以其序列特异性的优势被广泛应用于阻断或抑制基因表达，这也使得它成为基因功能和基因治疗的研究工具。在RNAi发挥基因沉默效能的过程中，许多因素都会直接或间接的影响最终的沉默效率和沉默时间。这些因素可被分别定位于3个不同的层次，包括siRNA类型的选择，siRNA的递送过程及细胞内的RNAi路径。本文分别就这3个层次和RNAi基因沉默动力学的数学模型及其应用做一综述，以期能帮助人们更深入地认识RNAi，促进RNAi在临床上的应用进程。

1 干扰RNA类型的选择

dsRNA是RNAi的初始诱导因子，但是，dsRNA必须被进一步加工成适当大小的siRNA才能发挥作用。RNAi的效应分子主要有两类，即siRNA和短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）。在被应用于引发基因沉默效应的过程中，化学合成的siRNA和载体表达的shRNA各存在其优缺点，现从4个方面予以论述。

1.1 siRNA和shRNA在产生非特异性反应方面的优缺点

siRNA在细胞内的稳定性较差，易被细胞内核酸酶降解，因此较易产生脱靶效应；shRNA在细胞核内产生，易于被细胞内的特异机制进行适当的剪接，因此引起免疫副反应的几率较小。细胞内过多的shRNA会与内源性的微小RNA（microRNA，miRNA）竞争核转运受体，干扰miRNA正常功能的发挥，产生细胞毒性作用，而siRNA不会干扰miRNA的功能，不会产生类似的毒性。与shRNA相比，siRNA易于被进行适当的修饰，在不影响其沉默效率的同时提高其稳定性，减轻非特异性反应的发生。

1.2 siRNA和shRNA在沉默效应的持续时间方面的优缺点

在分裂活跃的细胞中，固定数量的siRNA随细胞的分裂不断被稀释，导致其沉默效应的短暂性。载体表达的shRNA可被整合于宿主细胞染色体，由宿主细胞持续合成，使其沉默效应能维持较长时间。Rao D D等［3］研究表明，少于5个拷贝的shRNA整合入宿主染色体就能有效地引起长时间的基因沉默效应。Takahashi Y等［4］研究表明，载体表达的shRNA诱导的基因沉默效应的持续时间显著长于siRNA的沉默效应时间。

1.3 siRNA和shRNA在转染效率方面的优缺点

siRNA在细胞质中直接与RISC结合降解靶mRNA，因此，一旦siRNA进入细胞质便能立即发挥其基因沉默效应。相反，shRNA的表达载体需要首先被转染进细胞核，转录出shRNA，然后再将shRNA运出细胞核，在细胞质中被剪切成siRNA发挥作用。基因治疗研究表明，跨细胞核运输是转染过程中遇到的最大挑战之一。因此，在转染效率方面，siRNA较shRNA具有更大的优势。

1.4 siRNA和shRNA在临床应用方面的优缺点

化学合成的siRNA引起短暂的基因沉默效应，因此可根据治疗需要随时调整用量。shRNA表达载体通过插入基因组持续表达shRNA发挥作用，基因沉默效率相对较高。同时，插入shRNA表达载体的基因可因组蛋白的修饰和启动子区CpG岛的高度甲基化而被沉默，但这种染色质的沉默不仅不能引起长时间的转基因表达，还会导致转基因活性逐渐消失。而且，细胞核内shRNA连续的高浓度表达还会引起细胞毒性作用。

综上考虑，siRNA和shRNA在发挥RNAi效应的不同方面各存在优缺点，实际应用中应根据具体情况选择合适的小干扰RNA。

2 siRNA的递送

siRNA在细胞内发挥基因沉默，因此，化学合成的siRNA要想发挥沉默效应，必须经历从体外到细胞内的转染过程，在其到达正确的靶细胞位置之前，有许多细胞外因素会影响它的稳定性和传递效率，要想最终发挥良好的沉默效应，必须克服这些障碍。siRNA的系统性递送必须涉及提高其循环半衰期和组织靶向性的机制［5］。

2.1 机体中核糖核酸酶对siRNA的降解

众所周知，siRNA极不稳定，一旦进入机体，会很快被细胞外环境中的核糖核酸酶（RNase）降解，导致其在血液中的半衰期不足30min。通过对siRNA进行化学修饰的方法可以增强其对血液中RNase的稳定性［6］，保护其免受降解。化学修饰主要包括糖配基修饰、磷酸盐连接修饰、碱基修饰、末端悬挂碱基修饰和末端结构修饰以及双链结构修饰等［7］。这些修饰不会减弱siRNA的作用，相反，在提高其稳定性的同时，还可显著提高其沉默效率。

2.2 肾对siRNA的清除

除了RNase导致的降解外，由于siRNA高度亲水且其分子量很小，远远低于肾小球过滤的最小界限，它们可很快被肾小球滤过清除，因此，肾的清除是影响体内siRNA半衰期的重要限制因素。有些化学修饰（如RNA骨架中的硫代磷酸酯连接和4＇含硫核苷酸）可通过促进siRNA与血清蛋白的结合而提高它的半衰期。一种更方便快捷地调控和促进siRNA生物分布的方法就是通过连接于小分子量配基来改变siRNA的结构，几个比较令人关注的例子就是siRNA与抗体重链Fab片段，与胆固醇、胆汁酸和长链脂肪酸等油脂分子，与细胞渗透性多肽（cell－penetrating peptides，CPP）等 的 结 合［8－9］。 抗体可精确识别细胞内外抗原，实现siRNA的正确定位。siRNA有选择地结合进富含磷脂质和胆固醇（主要是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白）的脂蛋白颗粒内。这些亲脂性的siRNA－脂蛋白复合体通过回避肾的清除和经由脂蛋白的受体促进细胞的摄取而达到提高siRNA生物分布的作用。CPP又称为蛋白转导结构域或膜转导序列，它是短的阳离子多肽，最多含有30个氨基酸，它可以通过直接穿越细胞膜或通过细胞的内吞作用被摄取而达到传递siRNA到细胞内的作用。

2.3 siRNA的靶向性

siRNA准确高效的干扰作用的发挥要求siRNA必须具有靶向性。研究证明，体细胞对siRNA会产生强烈的炎症反应，非靶向的细胞会摄取大量siRNA，在大量消耗siRNA的同时，还增强了炎症反应的程度。由此可见，siRNA的递送方式也直接影响RNAi效应的发挥。要解决这一问题，就要找到适合特定组织的siRNA递送方式。目前，已有很多成功的例子。

核苷酸还原酶M2亚基（RRM2）是一个抗癌靶点，Davis M E 等［10］使用纳米颗粒包裹 RRM2 siRNA，并且在颗粒表面有转铁蛋白（TF）使其具有靶向性，将纳米颗粒分别在第1、3、8、10、21天通过静脉注射注入三位黑色素瘤患者体内，并且不同患者给予不同的剂量。在经过一个治疗周期后，肿瘤组织活检结果发现，纳米颗粒可以特异定位于肿瘤组织当中，而在其相邻的表皮中没有发现。肿瘤组织当中的纳米颗粒的密度随着给药剂量的增大而增强。此外，通过实时定量逆转录－PCR（qRT－PCR）来测定患者肿瘤组织当中的RRM2mRNA水平，经过纳米颗粒治疗后，该mRNA水平有显著降低，并且这一过程具有剂量依赖的关系。通过免疫组织化学染色及Western bot的方法证明在siRNA治疗后，RRM2蛋白质表达水平同样降低。这些结果提示，全身给予携带siRNA的靶向纳米颗粒后，该颗粒可以特异性地定位于肿瘤组织，并且有效地通过siRNA抑制靶基因的转录和翻译从而达到治疗效果。

脂质纳米颗粒（liposomal nanoparticles，LNPs）能有效地递送siRNA，尤其是其中的一类称为稳定核酸脂质复合物（stable nucleic acid lipid particle，SNALP），通过对脂类进行PEG修饰使得复合物获得了亲水性外层，从而增强了其在血浆中的稳定性。SNALP还增加siRNA的载荷并且改善细胞对siRNA的摄取及胞内释放，因此SNALP被应用于人临床治疗中多种肝靶向性的RNAi项目。最近2年，研究发现了2种新型的可电离的和阳离子的脂质［11－12］，它们具有良好的活性，可被应用于新一代的LNP－siRNA递送系统。它们都介导有效的LNP对siRNA的递送，分别被称为可电离的LNPs（iLNPs）和阳离子LNPs（cLNPs）。Akinc A 等［13］证明载脂蛋白E（apoE）是iLNPs的内源性的靶向性配基，它介导iLNPs对siRNA的肝靶向性运输。

3 细胞内的RNAi途径

siRNA在克服RNase的降解和肾的清除作用顺利进入细胞内后，也有很多因素会影响其沉默效率。

3.1 siRNA从内吞体的逃逸

被内吞作用摄取的siRNA通常会被困在内吞体中而无法扩散到细胞质中发挥作用，这种现象在主要通过内吞作用被摄取的siRNA载体中最常见。这种情况下，如何提高siRNA从内吞体的逃逸率成为关键问题。截至目前，已有多种方法被用于应对解决这一难题。在此以CPP的运输为例进行说明。CPP和siRNA的复合体主要通过内吞作用进入细胞，进入后即被困于内吞体内。主要有两种方法可以促进复合体的释放。其一，可将能破坏细胞膜稳定性的化学试剂或融合肽连接于siRNA／CPP复合体，通过破坏细胞膜促进siRNA的释放［14］。其二，可将光敏剂或荧光染料连接于siRNA／CPP复合体，在光刺激下，光敏剂或荧光染料诱导产生高活性的单线态氧，促进内吞体细胞膜破裂释放siRNA。而且，这种光诱导的siRNA释放方法还提供了一种从时空上控制RNAi的思路。Endoh T等［15］将一种仅在特定波长下才被激活的荧光染料连接于CPP上，通过控制光强度调节RNAi的发生。在这种情况下，光刺激不是RNAi的增强因子，而是激发因子。这样，就可人为地控制RNAi的发生时间，这对我们将RNAi应用于局部治疗是非常有利的。

3.2 细胞内AGO蛋白的可用性

AGO蛋白是影响siRNA沉默效率的主要的细胞内因子。Lund E等［16］研究表明，内源性Ago2核酸内切酶活性缺失的早期胚胎和卵母细胞不能发生RNAi。众所周知，AGO蛋白是RISC中具有mRNA剪切活性和翻译抑制活性的蛋白质，siRNA先导链只有装载于AGO蛋白上才能发挥基因沉默效应［17］。而AGO蛋白还可结合miRNA，也就意味着如果AGO蛋白大部分被miRNA占据，进入细胞内的siRNA就会找不到AGO蛋白来对其进行装载，导致siRNA未发挥作用就被降解。就这一点而言，细胞内RNAi的效率在很大程度上取决于AGO蛋白的可用性［18］。因此，如果要用外源性的siRNA来诱导RNAi，为取得良好的沉默效果，可以通过提高细胞表达AGO蛋白的效率来为外源siRNA提供充足的“空载”AGO蛋白。已经有研究证明，AGO蛋白的超表达可以提高哺乳动物细胞内的RNAi效率［19］。但是，目前仍不知道机体内AGO蛋白的表达是如何被调控的，也不知道如何控制AGO蛋白的表达，所以这方面还需进一步的深入研究。

3.3 病毒编码的RNAi沉默抑制因子

RNAi是机体内部固有的抗病毒机制，为了克服这种抗病毒反应，病毒也相应的编码一些RNAi沉默抑制因子（RNA silencing suppressor，RSS），这些RSS通过多种途径降低RNAi的沉默效应［20］。RSS主要以两种形式发挥作用：蛋白质形式和RNA形式。抑制蛋白可以通过抑制Dicer活性或者与dsRNA结合来降低RNAi的效率。病毒相关的RNA可以通过与Dicer和RISC结合使其达到饱和状态不能结合siRNA而阻止RNAi反应，它们还可以作为miRNA发挥作用抑制宿主mRNA的翻译，同时，它们还通过抑制Exportin 5的作用限制premiRNA从细胞核到细胞质的运输。为了提高RNAi效率，我们可以设计针对RSS的siRNA，通过限制RSS在细胞内的表达减轻它的抑制效应，从而使RNAi更好地发挥抗病毒作用。

3.4 预想的沉默目标

细胞内靶mRNA的数量和靶蛋白的稳定性也会影响siRNA的干扰效率［21］。细胞内siRNA的存活需要有效数量的靶mRNA的存在，因此靶mRNA的转录水平会直接影响siRNA在细胞内的持续时间。如果靶蛋白的半衰期很长，即使siRNA能够有效地抑制靶mRNA的翻译，由于残余数量的靶蛋白的存在，RNAi也不会改变细胞的表型。siRNA会随细胞的分裂而被稀释，细胞的分裂速率决定了RNAi的持续时间，因此靶细胞类型也会影响siRNA的干扰效率。

4 RNAi基因沉默动力学数学模型及其应用

综合以上分析，多种不同因素在不同层次上影响RNAi的效率，我们可以将各种关键的影响因素综合起来，建立数学模型，系统深入的分析各种因素的作用，并以此作为参考，合理地设计siRNA治疗方案，最终促进RNAi在治疗领域的应用。

BartlettD W等［22］第一次构建了包含诸如siRNA载体的生物分布和细胞内siRNA的释放等机体内控制siRNA运输过程的各种因素的数学模型，用来进行siRNA介导的基因沉默的动力学研究。模型分析的结果也被用于根据靶蛋白的半衰期和靶细胞分裂的速率来制定用药方案，通过重复的siRNA注射来诱发持续的基因沉默效应。Bartlett D W等［23］还进一步将他们的数学模型用于多项体内和体外的以阳离子环糊精为基础的siRNA纳米颗粒的基因沉默研究，用以提供更多的信息帮助设计更为有效的siRNA运输策略。

Vandenbroucke R E等［24］通过对数学模型的分析建立了体内siRNA按时间控制释放入细胞质的方法。他们运用带阳离子的能被生物降解的多聚β氨基酯类与带负电荷的siRNA形成纳米大小的静电复合体，通过内吞作用摄入细胞内。细胞内阳离子聚合物被水解，它们降解产物的积累会增加内吞小泡内的渗透压。当超过一定的压力极限时，内吞小泡会破裂。据猜测，聚合物的降解速率和单个内吞小泡内聚合物的数量会控制内吞小泡膜上渗透压的增长速率，因此，并不是所有的内吞小泡在同一时间破裂。通过这种方式，siRNA可依赖于聚合物的降解不断地释放到细胞质中，引起较长久的基因沉默效率。

与以上的方法相似，Raemdonck K等［25］还设计了浸有siRNA的微胶，通过水凝胶交联的水解引起其内包含的siRNA按时间控制释放。根据水凝胶的特性，siRNA的释放时间可以被随机调整，可以是几小时，几天，甚至几个星期。因为这种凝胶可被靶细胞摄取，它们可以作为细胞内储存siRNA的仓库，缓慢地降解，并释放其内包含的siRNA，引起较长久的基因沉默效应。

5 展望

RNAi技术由于其高效性和高度特异性，已成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段。然而，在RNA干扰试验积累的经验中发现，在RNAi发挥基因沉默效能的过程中，从siRNA类型的选择、siRNA向体内的递送直至siRNA进入细胞产生干扰效应等各个环节，许多因素都会直接或间接的影响最终的沉默效率和沉默时间。随着对这些因素的深入研究，必将会一一克服所有的困难和障碍，使RNAi技术在不久的将来得到普遍的应用。

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