针刺对神经干细胞海马内移植痴呆大鼠学习记忆和脑内胆碱能系统的影响*

杨春壮，徐永良，陆 迪，马彦文，关艳中，赵 微

(牡丹江医学院，黑龙江牡丹江157011)

老年性痴呆(AD)是一种以进行性认知功能障碍和学习记忆能力损害为主的中枢神经系统退变性疾病，尚缺乏有效的治疗方法。神经干细胞在中枢神经系统的存在并体外培养成功，为神经系统退变性疾病的研究提供了一种新的治疗策略。而针刺对神经干细胞(NSCs)移植后的影响文献报道较少。本实验采用β－AP向海马CA1区定向注射制做AD模型，利用体外分离培养的NSCs移植入AD大鼠，探讨NSCs移植后针刺对AD大鼠大脑皮层和海马胆碱能系统的影响。

1 材料和方法

1．1 仪器和试剂

脑立体定位仪(68001型，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，ZH－200型大鼠光电刺激跳台(安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司)，Multiskan MK3酶标仪(Thermo热电上海仪器有限公司)，ChAT酶联免疫试剂盒(上海劲马生物科技有限公司)，β－AP(美国Sigma公司)。

1．2 AD动物分组及模型的制备

健康成年雄性 Wistar大鼠60只，体重(300±50)g，随机分为5组，正常对照组(正常组)12只，其余单侧(左侧)海马注射β－AP制作AD模型。制造痴呆模型后，将其随机分成4组:模型组12只，针刺组12只，NSCs移植组(移植组)12只，移植后针刺组(移植针刺组)12只。

模型制备:大鼠用20%乌拉坦(0．55 ml/kg)行腹腔注射，按脑立体定位图谱(AP=2．22 mm ML=3．0 mm DR=2．8 mm)向海马注射1μlβ －AP(恒温培养箱37℃卵育1周，临用前生理盐水配制成5μg/μl浓度)。缓慢匀速推注，时间不少于5 min，再留针3 min。正常组不注射。

1．3 NSCs的分离和纯化及海马内NSCs移植

参照相关文献［1］方法进行。坐标为:AP=2．22 mm ML=3．0 mm DR=2．8 mm。

1．4 针刺选穴及方法［2］

电针百会、大椎、人中。百会位于顶骨正中;大椎位于第7颈椎与第1胸椎间，背部正中;人中位于唇裂鼻尖下1 mm正中处。针刺组和移植针刺组用0.32 mm×25 mm毫针针刺。采用KWD－808Ⅱ型全能脉冲电疗仪(青岛生产)，频率10 Hz，电压1．5 V，疏密波，以大鼠安静耐受为度，强度约为2 mA。留针10 min，持续电刺激，每天1次，共治疗30天。

1．5 跳台实验

针刺后进行跳台实验，24 h后重复测试，作为动物学习记忆成绩的指标。实验时，将大鼠放入装置中，适应环境5 min。以首次测试5 min之内大鼠逃到安全台上，再从安全台跳下的次数为学习成绩，24 h后重复测试，5 min之内大鼠逃到安全台上，再从安全台跳下的次数为记忆成绩。

1．6 ChAT 的检测

跳台测试完毕后，大鼠禁食过夜，将大鼠断头后在冰面上迅速取脑，分离大脑皮层和海马，生理盐水冲洗后，称重，制备成10%的组织匀浆，将匀浆液置于离心机2000 r/min离心20 min，取上清待测ChAT。ChAT的检测严格按试剂盒说明进行。

1．7 统计学方法

采用SPSS11．5统计软件分析，实验结果以平均值±标准差(±s)表示，单因素方差分析进行多组间均数比较，组内用t检验，P＜0．05为显著水平。

2 结果

2．1 针刺对各组大鼠学习记忆的影响

表1 针刺对各组大鼠学习记忆的影响(±s)

表1 针刺对各组大鼠学习记忆的影响(±s)

注:与模型组比较，1)P ＜0．05;与正常组比较，2)P ＜0．05;与移植组比较，3)P ＜0．05。

12 13．5 ±2．5 10．8 ±3．4模型组 12 34．4 ±5．32) 31．5 ±6．12)移植组 12 22．6 ±1．81) 15．9 ±2．51)针刺组 12 25．8 ±6．31) 18．6 ±4．41)移植针刺组 12 15．3 ±3．61)3) 9．2 ±2．11)3)组别 例数 学习所需次数 记忆所需次数正常组

表1显示，模型组与正常组比较，学习、记忆所需次数明显增多(P＜0.05)，说明痴呆模型制造成功;治疗30天后，针刺组、移植组和移植针刺组与模型组比较，次数显著减少(P＜0.05);而移植针刺组与移植组相比较，次数显著减少(P＜0.05)，说明针刺和移植联合应用效果更佳。

2．2 针刺后各组大鼠皮层、海马ChAT含量的定值比较

表2 针刺后各组大鼠皮层、海马ChAT含量的定值比较(±s，n=12)

表2 针刺后各组大鼠皮层、海马ChAT含量的定值比较(±s，n=12)

注:与模型组比较，1)P ＜0．05;与正常组比较，2)P ＜0．05;与移植组比较，3)P ＜0．05。

71．583 ±17．731 75．167 ±25．83模型组 32．383 ±10．4872) 23．49 ±13．082)移植组 57．375 ±6．59111) 42．95 ±12．431)针刺组 55．371 ±17．8531) 50．93 ±20．631)移植针刺组 67．575 ±14．8721)3) 64．08 ±46．081)3)组别 皮层 海马正常组

表2显示，模型组与正常组比较，皮层、海马的ChAT含量明显降低(P＜0.05);30天后，针刺组、移植组和移植针刺组与模型组比较，显著提高(P＜0.05);而移植针刺组与移植组比较，显著增加。

3 讨论

经验证，针灸疗法对AD疗效肯定，尤其是电针疗法应用最为广泛。电针疗法对神经系统调节的特殊作用使它在脑部疾病治疗领域上具有特殊优势。

中医文献中无“老年性痴呆”的病名，根据其临床表现认为本病属中医“呆病”、“健忘”、“癫证”等范畴。其病因病机为肝肾亏虚、气滞血瘀，以肾气虚衰、髓海空虚、脑神失养为其根本。百会和大椎均属督脉穴位，百会为“三阳五会”，大椎为“诸阳之会”，为手足诸阳之会。督脉与脑密切相关，督脉通于脑。人中位于鼻下嘴上，正是“诸阳之海”的督脉与“诸阴之海”的任脉交会点。针刺此三穴可以激发经气，疏通经络，使脑髓得气血之荣养而复聪。

胆碱能学说在AD发病机理的诸种假说中影响最广泛，学术界普遍接受［3］。中枢胆碱能通路是构成学习记忆的重要通路。乙酰胆碱(ACH)是中枢神经系统中最重要的神经递质，是迄今发现的与学习记忆关系最密切的一种神经递质。ChAT为胆碱能神经递质ACH的合成酶，常用来做为胆碱能活性指标［4～5］。通过检测治疗前后脑组织中ChAT含量，即可推测出ACH的含量，从而判断老年性痴呆鼠的智能及记忆损害程度。

资料结果显示，神经干细胞移植到脑内不同部位后，能够根据宿主脑内的微环境分化为不同脑区的神经细胞［6－8］。本研究中移植的神经干细胞使大脑皮层和海马的胆碱能神经元及功能得到明显改善和增强，从而提高其学习记忆能力。模型组大鼠大脑皮层和海马内ChAT活性明显低于正常组，统计学结果显示两者有显著性差异(P＜0．05)，提示脑内胆碱能神经元损伤，功能降低，ACH合成率下降的原因可能是CHAT活性下降，因而造成学习记忆功能缺损。经电针治疗后，ChAT活性升高，调节了ACH生理代谢，改善了胆碱能系统的功能，从而改善了认知障碍，达到治疗VD的目的。同时结果还显示，神经干细胞移植后再进行针刺对大脑胆碱能系统的调节效果更好。

［1］ 罗秀梅，龙大宏，杨丹迪，等．NSCs移植对AD鼠基底前脑胆碱能神经元和学习记忆能力的影响［J］．中国临床解剖学杂志，2007，2(3):293－297

［2］ 杨春壮，李明秋，王莹，等．针灸对血管性痴呆大鼠行为学及组织内乙酰胆碱酯酶含量的影响［J］．针灸临床杂志，2011，27(7):71－73

［3］ Giacobini E．Cholnergic function and Alzheimer’s disease［J］．Int J Geriatr Psychiatry，2003，18(Suppl):S1

［4］ Nordberg A．Functional studies of cholinergic activity in normal and Alzheimer disease states by imaging technique［J］．Prog Brain Res，2004，145:301

［5］ Lai MK，Tsang SW，Garcia － Alloza M，et al．Selective effects of the APOE epsilon 4 allele on presynaptic cholinergic markers in the neocortex of Alzheimer’s disease［J］．Neurobiol Dis，2006，22(3):555

［6］ Wang TT，Jing AH，Luo XY，et al．Neural stem cells:isolation and differentiation into cholinergic neurons［J］．Neuroreport，2006，17(13):1433－1436

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