富勒烯的化学修饰技术及其修饰产物在疾病预报中的应用

李园园，李志明，郑志勇



富勒烯的化学修饰技术及其修饰产物在疾病预报中的应用

李园园1，李志明2*，郑志勇2

（1.漳州科技职业学院，福建 漳州 363202；2.漳州职业技术学院，福建 漳州 363000）

开发了N ,N -二乙基苯胺(DEA)-富勒醇(F)-异硫氰酸荧光素（FITC）磷光标记试剂(DEA-F-FITC)及建立DEA-F-FITC标记伴刀豆凝集素(Con A)亲和吸附(AA)固体基质室温燐光法(AA-SS-RTP)测定AFP-V新方法。该方法的灵敏度高(Pg/mL)为0.13(F)和 0.090(FITC)，用于测定人血清样品中AFP-V的含量和人体疾病预报，结果都与酶联免疫法的相吻合。

富勒烯；化学修饰技术；应用

1 引言

肝癌(HCC)是人体最常见的恶性疾病之一。当前HCC的诊断有化学免疫法[1],荧光诊断法[2], 磁性共振法[3], 三维投影放射性疗法[4]等。遗憾的是上述诊断的方法仅处于定性、半定量水平。研究表明，AFP-V含量与原发性肝癌密切相关。Sato 等报道[5]，AFP-V升高的肝硬化病人大多数在3～18个月内被诊断为肝癌患者。AFP-V预测HCC发生的正确率为94%[6]。国内外测AFP-V含量的方法有亲和电泳酶免疫法(LD =1.0×10–9ng/mL)[7]、亲和吸附 (LD =9.0×10–10 g/mL)法[8]、时间分辨荧光免疫法(竞争法的LD = 9.4 ×10–10 g/mL，夹心法的LD =3.0×10–10 g/mL)[9]、抗体亲和印迹法(LD< 4.0×10–7g/mL)[10]等。但诸类方法或是操作繁杂、费时、灵敏度不高, 难以满足生物试样中低含量AFP-V测定。显然，探索高灵敏、准确测定AFP-V的新方法与预报HCC，在生命科学领域具有重要学术价值和应用前景。

凝集素、糖、糖链结构的研究已成为当前生物医学领域中的热点和前沿课题。近年来，凝集素作为一种糖基探针，已用于糖蛋白、糖脂、糖结构及碱性磷酸酶研究[11-12]。因此，寻找凝集素的高效标记试剂，已成为生物分析的关键。文献报道了C50Cl10等富勒烯衍生物本身具有一定的发光特性。Caspar和Wang[13]曾用N ,N -二乙基苯胺(DEA)修饰C60，使其荧光大大增强。此研究测量的虽然是荧光信号, 显然其原理对磷光亦是适合的。

实验研究发现，DEA对F、FITC在ACM上发射的室温燐光(RTP)信号有显著的增强作用。由此设想，用DEA修饰F、FITC的产物标记Con A的产物(DEA-F-FITC-Con A)与AFP-V发生AA反应，探索高灵敏AA-SS-RTP测定痕量AFP-V的可能性。本研究为SS-RTP的发展提出新的出路，同时推动富勒烯修饰技术与应用的进展。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LS-55型荧光分光光度计及固体前表面处理器，仪器参数：Delay 0.1ms，Gate 2.0ms，Cycle 20ms，Flash Count 1，Ex Slit 10nm，Em Slit 15nm，Speed 1500nm/min；KQ-250B型超声波清洗器；AE240型电子分析天平；0.50 µL平头微量注射器。

AFP-V、牛血清蛋白(BSA)、Con A购于sigma 公司，并保存于0－4℃冰箱中。临用时分别稀释成1.00、100.00(pg/mL)AFP-V、700.0 ng/mL Con A、10 mg/mL BSA、1.0×10–5mol/L F[14]; 1.0×10–5moL/L FITC；1%(V/V)DEA；0.10moL/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，0.067mol/L KH2PO4-Na2HPO4缓冲液；0.050mol/L Tris-HCl缓冲液；Tris-HCl-0.1%Tween-20洗涤缓冲液；10.0 mg/mL BSA包被液(0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3稀释）；Tris(三羟甲基氨基甲烷），HCl，NaCl，Tween-20，1.0 moL/LPb(Ac)2溶液；HAc等。除了BSA为生物试剂外，其余试剂为分析纯，水用三次亚沸蒸馏水。

聚酰胺素膜(PAM)、ACM、硝酸纤维素膜(NCM)购于路桥四甲生化塑料厂。预先剪切成Ф = 1.5 cm的圆片备用。

2.2 实验方法

2.2.1 Con A的标记

用0.50μL微量进样器，将0.4μL不同浓度与用量的Con A(W/V，pH=7.4的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液稀释)悬空点样在ACM的中心压痕(Ф=4 mm)处，然后取出ACM，在ACM的中心压痕处加0.4μL标记试剂(1.50mL 1% DEA-0.40mL1.0×10–5mol/L F-5.00 mL 1.0×10–5mol/L FITC)乙醇溶液。在37℃时静置反应2h，得Con A与DEA-F-FITC反应而生成的标记产物(DEA-F-FITC-Con A）。取出标记产物，经洗涤液冲洗，超声波振荡重复洗涤3次，除去ACM上未反应的标记试剂，用滤纸吸干，备用。根据DEA-F-FITC-Con A与AFP-V AA反应产物的RTP测量结果，筛选DEA-F-FITC标记Con A的最佳浓度与用量。

2.2.2亲和吸附反应与室温燐光检测

采用夹心法进行亲和吸附反应。在ACM的中心压痕(Ф=4 mm)处，用0.5μL微量进样器点加0.40μL的Con A于同一压印痕处, 于4℃下放置过夜, 继而在BSA包被液中37℃浸泡0.5 h，用0.50μL微量进样器将0.4μL不同浓度的AFP-V溶液(用pH=9.12 Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液逐级稀释)悬空点样在PAM的中心压痕(Ф=4 mm)处，于37℃下温育2 h，再洗涤3次，用滤纸吸干；然后点加0.4μL已标记的Con A (DEA-F-FITC-Con A)于同一印痕处，于37℃下温育2 h，再洗涤3次，用滤纸吸干；浸入Pb(Ac)2溶液中，10s后取出，于(90 ±1)℃下干燥2min，扫描其燐光光谱，记录试剂空白(DEA-F-FITC-Con A+Con A)的p1和试样(DEA-F-FITC-Con A- AFP-V- Con A)的p2，平行测定7份，计算∆p(p2－p1)。

2.2.3样品处理

取1.00 mL A、B、C、D、E、F人血清，加入0.50mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(含0.50 mol/L NaCl)，混匀10min，离心弃上清液后，再加入1.0mL缓冲液。混匀10min，置于4℃备用。然后加入Sepharose 4B 吸附剂，离心弃上清液，用0.010mol/LTris-HCl 缓冲液稀释至pg级，在振荡器上振摇300 r/min 20min。经200 r/min离心5min，按实验方法测定上清液中的AFP-V同时做加入标准回收率实验，并与漳州市中医院ELSIA法临床检测的结果比较。

3 结果与讨论

3.1 亲和吸附产物的SS-RTP光谱

图1 DEA- F-FITC-Con A-AFP-V- Con A法磷光光谱（F）

图2 DEA- F-FITC-Con A-AFP-V- Con A法磷光光谱（FITC）

表1 DEA- F-FITC-Con A-AFP-V-Con A体系的磷光特性（F和FITC）

3.2 最佳测定条件

3.2.1试剂浓度与用量

对于40.0 fg AFP-V，按实验方法检测F和FITC的p值，分别考察试剂浓度和用量对体系的Δp值的影响。结果表明，试剂浓度与用量为0.40mL 1.0×10–5mol/L F、5.0 mL 1.0×10–5mol/L FITC、1.50 mL 1.0％DEA 时，体系的Δp值最大且稳定。

3.2.2固体基质

对于40.0 fg AFP-V，固体基质分别为ACM、PAM、NCM时，体系中F的Δp依次为30.1、12.6与8.4 ，FITC的Δp依次为 45.8、23.5与11.0。结果表明：采用ACM时FITC和F的Δp值都最大。

3.2.3增敏剂

对于40.0fg AFP-V，增敏剂分别为DEA、十二烷基磺酸钠、聚丙烯酸钠、溴代十六吡啶时，体系中F的Δp依次为30.1、12.5、16.6与24.4，FITC的Δp依次为 45.8、32.9、39.3与45.5。结果表明：采用DEA时F和FITC的Δp值最大值，故采用DEA为增敏剂。

3.2.4离子微扰效应

对于40.0 fg AFP-V，离子微扰剂分别为1.00 mol/L的Hg2＋、Ba2＋、Pb2+、Ag+时，体系中F的Δp依次为26.3、22.1、30.1与17.5，FITC的Δp依次为40.0、33.7、45.8与26.6；当Pb2+浓度分别为 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5时，体系中F的Δp依次为26.7、29.9 、30.1、30.0、29.9与29.9，FITC的Δp依次为40.3、43.7、45.8、45.3、45.5 与45.5。选取1.00mol/L Pb2+为离子微扰剂时，Δp值最大且稳定。

3.2.5. 烘干温度与时间

对于40.0 fg AFP-V，分别研究了烘干温度和时间对体系的Δp的影响。结果表明，烘干温度分别为60、70、80、90、95(℃)时，体系中F的Δp依次为20.1、23.5、26.8、30.1与27.8，FITC的Δp依次为30.6、35.7、40.8、45.8与41.5；当烘干时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0与2.5(min)时，体系中F的Δp依次为7.5、15.1、22.6、30.3 与 25.7，FITC的Δp依次为11.5、23.0、34.5、45.8与41.5；其中90℃、2min时Δp值最大且稳定。

3.2.6氧气及湿度

对于40.0 fg AFP-V，按实验方法考察氧气及湿度对体系的Δp的影响。结果表明，通干燥N2分别为5、10、15、20、25、30、35 min时，体系F的∆p依次为30.2、30.1、29.9、30.1、30.2、29.8、30.1，FITC的Δp依次为45.7、45.8、45.6、45.8、45.6、45.7、45.8；不通干燥N2，时间为5、10、15、20、25、30、35 min时，体系F的∆p依次为30.1、28.3、25.0、20.2、17.3、14.2、10.3，FITC的Δp依次为45.4、41.5、39.8、35.7、30.9、27.6、24.7。表明，在通干燥的N2的条件下体系是稳定的。

3.2.7 RTP发射的稳定性

在上述条件下，体系放置时间为10、20、30、40、50、60 和70 min时，F的Δp依次为30.1、30.1、30.1、30.1、30.1、29.9 和29.9，FITC的Δp依次为45.8、45.8、45.8、45.8、45.8、45.7和45.3；体系在50 min内Δp值几乎不变，重现性好。

3.3 工作曲线、检出限和精密度

用F-FITC-DEA标记Con A，亲和吸附方式测定AFP-V，其含量与Δp值成线性关系。工作曲线、线性系数、检出限（按3b/,= 11计算）和相对标准偏差 (%)等列于表2。表明亲和吸附方式测定AFP-V的灵敏度高、线性范围宽和精密度好。

表2 方法的检出限、精密度

3.4 人血清中AFP-V含量的测定与人体疾病预报

取1.00 mL上清液，按实验方法测定上清液中的AFP-V, 同时做加入标准回收率实验，并与漳州市中医院ELSIA法临床检测的结果比较（表3）。

表3 人血清中AFP-V含量的分析结果

注：“+”表示有占位性病变，“－”未见占位性病变。

由表3可见, 本法的RSD%为1.5－4.3(%)，回收率%为98.4－103(%)。无论选用F或FITC法测定人血清样品中AFP-V的含量，其结果与酶联免疫法(ELISA)的相吻合。根据AFP-V含量＞355.6μg/L，临床诊断A、B、C患有PHC；AFP-V含量＜355.6μg/L，临床诊断D、E、F为健康人。此后，对A、B、C进行治疗，4周后用本法测定血清中AFP-V含量＜355.6μg/L，表明已达到健康人的水平。经B超、CT等检查，未见占位性病变。由此表明，本方法不仅适用于人血清中AFP-V含量的测定，还可用于人体疾病的测报。

4 结语

将高灵敏的SS-RTP与AA反应的高特异性相结合，建立了灵敏、准确测定痕量AFP-V新方法。新的F-FITC磷光标记试剂的开发与应用，不仅提高了AA-SS-RTP的灵活性和适应性，而且为F、凝集素提供了新的应用领域。

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Chemically Modified Technique of Fullerene and its Application in Diseases Prediction

LI Yuan-yuan1, LI Zhi-ming2, ZHENG Zhi-yong2

（1.Zhangzhou college of science & technology Zhangzhou, 363202, China 2.Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou, 363000, China）

The phosphorescent labeling reagent N, N-dimethylaniline-fullerol-fluorescein isothiocyanate (DEA-F-FITC) has been developed. A new affinity adsorption-solid substrate-room temperature phosphorimetry (AA-SS-RTP) for the determination of alpha-fetoprotein variant (AFP-V) had been established, based on DEA-F-FITC as a labeling reagent of concanavalin agglutinin (Con A). This method has high sensitivity (The detection limits (Pg/mL) are 0.13 for F and 0.090 for FITC, respectively), which has been applied to the determination of trace AFP-V in human serum and the forecast of human diseases, and the results agreed well with those obtained by enzyme-linked immunoassay.

Fullerene; Chemically modified technique;Application

2012－09－30

福建省教育厅科技项目资助（JB11308）

李园园(1983－)，女，山东菏泽人，助教。主要从事化学方面研究。 通讯作者联系电话0596-2660301，电子邮件：zzylzm@163.com。

O613.71

A

1673-1417（2012）04-0007-06

（责任编辑：季平）