HPLC法测定沙利度胺片中有关物质的含量

邱 娟，伍良涌（广州市药品检验所，广州 510160）

沙利度胺为谷氨酸衍生物，最早作为镇静药和镇痛药用于治疗妊娠恶心、呕吐，后因其严重的致畸和神经毒性副作用而退出市场。研究[1]发现沙利度胺与抗麻风病药合用可以减少麻风反应，治疗各型麻风证如结节性红斑。另有研究[2]发现沙利度胺对人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、肿瘤引起的恶液质、卡伯氏肉瘤、口腔溃疡以及慢性移植物抗宿主反应病等有疗效。沙利度胺片的质量标准收载于国家药品标准[3]中，但其标准中未收载有关物质检查项。国内、外药典中仅《美国药典》收载其胶囊剂，笔者参考《美国药典》沙利度胺胶囊剂项下有关物质检查方法[4]并结合国内实际生产情况建立了准确、可靠，且专属性强的测定沙利度胺片有关物质含量的高效液相色谱（HPLC）法，结果表明该法能够很好地控制产品质量，保证用药安全。由于本品在中性或碱性条件下易降解生成邻苯二甲酸，因此采用邻苯二甲酸作为有关物质检查的对照品。

1 仪器与试药

1200型HPLC仪（美国Agilent公司）。

沙利度胺标准品（批号:100504-200501，纯度:100.0%）、邻苯二甲酸标准品（批号:100903-200601，纯度:100.0%）均由中国食品药品检定研究院提供；沙利度胺片（常州制药厂有限公司，批号:0710081、07122714，规格:每片 25 mg；批号:0710091、07111513，规格:每片50 mg）；乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Waters Nova-Pak C18（150 mm×3.9 mm，4 μm）；流动相:水-乙腈-磷酸（梯度洗脱），水-乙腈-磷酸＝95∶5∶0.1为流动相A，水-乙腈-磷酸＝85∶15∶0.1为流动相B；梯度洗脱程序:0 min流动相A为100%、流动相B为0，0～15 min流动相A由100%变为50%、流动相B由0变为50%，15～20 min流动相A由50%变为100%、流动相B由50%变为0，20～30 min流动相A为100%、流动相B为0，流速:2.0 mL·min－1；检测波长:218 nm；柱温:40 ℃；进样体积:200 μL。

2.2 系统适用性试验

称取沙利度胺标准品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，作为溶液a；另取邻苯二甲酸适量，用乙腈-水（80∶5）混合液溶解并定量稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，精密量取适量，用乙腈稀释制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作为溶液b；精密量取溶液a、b各2 mL，置于同一100 mL量瓶中，用水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液稀释至刻度，摇匀，精密量取10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，沙利度胺峰的保留时间约为14 min，邻苯二甲酸峰的相对保留时间约为0.3。色谱见图1。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液的制备:取沙利度胺片细粉适量（约相当于沙利度胺0.1 g），精密称定，置于50 mL量瓶中，加水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液适量，超声振荡使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取续滤液10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

图1 系统适用性试验高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability test

2.3.2 标准品溶液的制备:取邻苯二甲酸标准品适量，用乙腈-水（80∶5）混合液溶解并定量稀释制成每1 mL中含1 mg的溶液，精密量取适量，用乙腈稀释制成每1 mL中含0.1 mg的溶液；再精密量取2 mL，置于100 mL量瓶中，用水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液稀释至刻度，摇匀，作为标准品贮备液。精密量取标准品贮备液10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液。

2.3.3 空白辅料的制备:按处方比例制备不含沙利度胺的空白辅料，按“2.3.1”项下方法制备空白辅料溶液。

2.4 专属性试验

取“2.3.1”项下供试品溶液10 mL 5份分别用稀盐酸溶液、10%氢氧化钠溶液、30%过氧化氢溶液、365 nm紫外灯照射及沸水浴加热进行破坏后，进样测定，同时取未破坏供试品溶液进样分析。结果表明，本品在强酸、强碱、氧化、高温、光照等剧烈条件下均产生多个杂质峰，对于强碱尤为敏感；建立的色谱条件对杂质峰能进行分离，色谱见图2。

图2 专属性试验高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of specification test

2.5 标准曲线的制备

分别精密吸取“2.3.2”项下标准品贮备液1、2、5、10、15、20 mL，置于不同100 mL量瓶中，加10 mL磷酸溶液（1→100），加水定容至刻度，分别取各浓度溶液200 μL进样测定。以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）作为横坐标，绘制标准曲线，求得邻苯二甲酸回归方程:Y＝466.998X－0.584（r＝0.999 9，n＝6），表明邻苯二甲酸检测浓度线性范围为0.02～0.50 μg·mL－1。

2.6 精密度试验

取标准品溶液连续进样6次，以邻苯二甲酸峰面积计算RSD＝0.3%（n＝6）。

2.7 重复性试验

按“2.3.1”项下方法制备批号为0710081的供试品6溶液份，进样、测定。结果样品中最大单个杂质含量的RSD＝1.5%（n＝6），杂质总量的RSD＝1.0%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取供试品溶液分别在0、3、6、13、20 h测定，得沙利度胺峰面积的RSD＝0.1%，杂质量未有明显增加，表明供试品溶液在20 h内稳定。

2.9 检出限

分别取沙利度胺标准品、邻苯二甲酸标准品适量，制成溶液，逐步稀释进样，记录色谱图，以信噪比（S/N）＝3时的浓度计算得沙利度胺的检出限为9 ng，邻苯二甲酸的检出限为1.2 ng。

2.10 样品有关物质含量测定结果

分别称取4批沙利度胺片各2份，照“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定。在供试品溶液的色谱图中，如有杂质峰，按外标法以邻苯二甲酸峰面积计算。结果批号为0710081、07122714、0710091、07111513的样品中最大单个杂质含量分别为0.07%、0.09%、0.08%、0.09%，杂质总量均为0.1%。

3 讨论

3.1 色谱柱的选择

从二极管阵列检测器（DAD）记录信号中提取邻苯二甲酸、沙利度胺及沙利度胺主要降解产物在200～400 nm波长的光谱图，发现最大吸收基本在218 nm波长附近，因此确定检测波长为218 nm。

本试验共考察了6种不同厂家牌号规格的色谱柱，分别为Welch Materials公司的Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent公司的ZORBAX SB C18（150 mm×3.0 mm，3.5 μm），Waters公司的Nova-Pak C18（150 mm×3.9 mm，4 μm），迪马公司的Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），Phenomenex公司的Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。除Nova-Pak C18及ZORBAX SB-C182种高效柱外，其他规格的普通色谱柱分析时间较长，沙利度胺主峰的保留时间均在30 min以后，且峰形较差，理论板数较低。最终确定采用Waters公司的Nova-Pak C18，或者可采用同等柱效的色谱柱。

3.2 色谱条件的选择

笔者采用文献[5]报道的色谱条件进行分析，结果发现各色谱图中主成分保留时间并不一致，且供试品检出的杂质处于2个溶剂峰之间，易受干扰，影响杂质测定的准确性。在专属性考察中，采用该文献的破坏条件未有较多杂质检出，且杂质分离情况欠佳。本研究采用较为剧烈的的破坏条件（主要指酸、碱、氧化破坏试验中所用试剂的浓度均大于文献报道所采用的浓度，光照及加热破坏试验条件也强于文献所述的条件）使得主成分沙利度胺产生明显的降解产物，采用所建立的色谱条件均能使降解产物有较清晰的分离，并且空白辅料峰的保留时间均在1 min内，从而避免了干扰其他杂质峰的检出。

3.3 进样体积的选择

根据目前国内实际生产情况，若按常规采用20 μL进样体积，杂质检出量较低，不能真实反映产品的质量。曾尝试制备浓度为2 mg·mL－1的供试品溶液而只进样20 μL，但结果发现沙利度胺在水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液中的溶解性较差，无法完全溶解，影响沙利度胺片有关物质的检出。因此最终确定制备浓度为0.2 mg·mL－1的供试品溶液而选择进样体积为200 μL，确保有关物质检查准确、有效。

3.4 溶液的选择

本研究参考《美国药典》沙利度胺胶囊剂[4]项下方法，采用与流动相相近组成比例的混合溶液溶解样品，能够避免出现较为明显的溶剂峰。沙利度胺合成原料为邻苯二甲酸酐和谷氨酸，沙利度胺在偏酸性条件下较稳定，在中性或偏碱性条件下易分解，加入适量磷酸溶液可以避免样品发生降解。

[1]徐浩翔.沙利度胺在皮肤科的应用进展[J].中国麻风皮肤病杂志，2009，25（11）:829.

[2]陈金月.沙利度胺的药理作用与研究进展[J].医药导报，2004，23（3）:177.

[3]国家药典委员会.国家药品标准（化学药品地方标准上升国家标准）第十一册[S].北京:人民卫生出版社，2002:118.

[4]The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopeia-The National Formulary（USP32-NF27）[S].Philadelphia:National Publishing，2008:3 704.

[5]欧贝丽，尹小英，徐菊芳，等.反相高效液相色谱法测定沙利度胺的有关物质[J].中国药学杂志，2008，43（6）:465.