RP-HPLC法测定盐酸卡替洛尔口腔崩解片主药及有关物质的含量Δ

聂延君，罗永煌，刘艳玲，田朋鑫（西南大学药学院，重庆 400715）

盐酸卡替洛尔（Carteolol hydrochloride，CH）是一种具有内在拟交感活性的β受体阻滞药，可用于心脏神经症（Cardiac neurosis）、小儿法洛四联症（Congenital fetralogy of fallot）、高血压、心律失常、心绞痛、心肌梗死等的治疗[1，2]。CH最早由日本大冢制药株式会社于1972年研制成功，1991年收载于日本第十二版药局方[3]，剂型有片剂、颗粒剂、滴眼剂和缓释胶囊剂等。《中国药典》从2000年版（二部）开始收载CH（原料药）及其滴眼液，国内目前仅有其滴眼剂上市。

本课题组与重庆市北碚现代应用药物研究所紧密合作，在深入研究心脏神经症的基础上，研制开发了CH的口腔崩解片，已申请发明专利[4]。本文参照《美国药典》CH普通片含量测定方法进行试验，发现主峰保留时间短，与杂质的分离度低，且峰拖尾、柱效低、理论板数不足3 000，因此，对流动相Na2HPO4的浓度和pH值以及其与乙腈的比例进行了优化调整，最终建立了测定CH口腔崩解片（CHT）主药及有关物质含量的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法。

1 仪器与试药

HPLC仪，包括二极管阵列检测器、LC-20AD泵、LC solution液相色谱工作站、色谱柱VP-ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）均为日本岛津公司产品；色谱柱Hypersil BDS C18（大连依利特分析仪器有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm）；Ultimate XB C18（南京利尔实验仪器设备有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm）；PHS-3C型酸度计（上海虹益仪器仪表有限公司）；药品强光照射实验箱（重庆市永兴实验仪器厂）。

CH对照品（重庆市北碚现代应用药物研究所，批号:100801，纯度:99.86%）；CHT（自制，批号:101027、101029、101031，规格:每片5 mg）；乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:0.17%的Na2HPO4溶液（以1 mol·L－1的H3PO4调节pH至3.0±0.05）-乙腈＝85∶15，流速:1 mL·min－1；检测波长:251 nm；柱温:30 ℃；进样量:20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品与对照品溶液的制备。取至少20片CHT，研细，精密称定约相当于10 mg CH的粉末，加50 mL的流动相溶解，转入100 mL量瓶中，机械振摇1 h，再以流动相定容至刻度，摇匀，过滤；精密量取续滤液10 mL，置于100 mL量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。另取CH对照品适量，加流动相溶解并制成每1 mL中含10 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 有关物质溶液的制备。精密称取“2.2.1”项下粉末适量（约相当于CH 25 mg），流动相溶解并定容至50 mL，过滤，续滤液作为供试液；精密量取1 mL供试液置于100 mL量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，作为对照液。

2.2.3 辅料溶液制备。按处方比例取不含CH的辅料，按“2.2.2”项下制备供试液的方法制备辅料溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下的5种溶液各适量，在“2.1”色谱条件下进样测定。结果显示，主峰峰形对称、尖锐，拖尾因子符合要求，主峰与辅料峰、杂质峰及溶剂峰能很好地分离，分离度大于1.5，理论板数按CH峰计算不低于3 000，色谱见图1、图2。

图1 CHT含量测定高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of content determination of Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablets

图2 CHT有关物质检查高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms of content determination of related substances of Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablets

2.4 专属性试验

精密量取“2.2.2”项下供试液5 mL置于25 mL量瓶中，制备4份，分别进行以下操作:加入1 mol·L－1NaOH溶液，于100 ℃水浴加热2 h；加入1 mol·L－1的HCl溶液，于100 ℃水浴加热6 h；加入3%的H2O2溶液，于100℃水浴加热10 min；室温放置。上述4种溶液分别作为碱破坏、酸破坏、氧化破坏和未破坏样品。另精密量取“2.2.3”项下辅料溶液5 mL置于25 mL量瓶中，制备4份，同法处理。处理完毕后，分别从中各精密量取2 mL至10 mL量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，过滤待测。另取“2.2.1”和“2.2.3”项下供试品和辅料粉末适量，置于（4 500±500）lx下强光照射10 d，10 d后取出制备成5 μg·mL－1光破坏样品溶液。取上述10种样品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图3。

图3 CHT专属性试验高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms of specificity test of Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablets

由图3可见，CH在碱及氧化条件下不稳定，产生少量杂质；在酸和光照射条件下比较稳定，几乎不发生降解。其中在酸条件下经计算仅降解了1.5%，将另一酸破坏样品置于80℃水浴24 h，降解率也仅为1.8%，表明本品在酸条件下非常稳定。各降解产物与主成分峰均能达到良好分离。

2.5 标准曲线的制备

精密称取CH对照品适量，按“2.2.1”项下方法制备1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL－16个不同浓度的对照品溶液，进样。以浓度（x，μg·mL－1）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程为:y＝33 419x+4 040.5（r＝0.999 8）。结果表明，CH检测浓度的线性范围为1.25～40.0 μg·mL－1。

精密称取CHT粉末适量，制备1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL－16个不同浓度的对照液，进样。同法得线性回归方程为:y＝33 618x+3 662.7（r＝1.000）。结果表明，有关物质对照液检测浓度的线性范围为1.25～40.0 μg·mL－1。

2.6 日内精密度试验

按“2.2.1”方法制备10 μg·mL－1的对照品溶液，滤过，分别在下午和晚上由不同的分析人员连续进样6次，结果日内RSD＝0.5%（n＝12）。

2.7 重复性试验

取同一批CHT，按“2.2.1”项下方法制备6份供试品溶液，进样测定，结果，含量的RSD＝0.54%，表明本方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取“2.2.1”项下供试品溶液，室温放置，分别于0、0.5、1、2、4、6、8 h进样测定，计算。结果，含量的RSD＝0.16%，表明供试品溶液在室温下8 h内稳定。

2.9 回收率试验

取“2.2.2”项下供试液，从中精密量取0.8、1.0、1.2 mL，置于3个50 mL的量瓶中，以“2.2.3”项下制备的辅料溶液稀释、定容至刻度，滤过，进样，测定含量，计算回收率，结果低、中、高浓度的平均回收率分别为101.4%（RSD＝0.12%）、101.3%（RSD＝0.07%）、101.4%（RSD＝0.03%），详见表1。

表1 回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests

2.10 最低检测限和最低定量限测定

取“2.2.1”项下对照品溶液，加流动相不断稀释，记录峰面积，在信噪比（S/N）为3∶1时测得最低检测限为6.3 ng，在信噪比（S/N）为10∶1时测得最低定量限为20.8 ng。

2.11 系统耐用性试验

取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”色谱条件下改变流速，分别在0.8、1.0、1.2 mL·min－1时进样，各色谱峰的保留时间稍有位移，但峰形仍良好，分离度符合要求。选用3种色谱柱（VP-ODS C18、Hypersil BDS C18、Ultimate XB C18）进行系统适用性试验，结果，主峰峰形、理论板数、分离度均能达到要求，结果见表2。

表2 耐用性试验Tab 2 Results of durability test

2.12 样品中主药含量测定

取3批CHT各若干片，照“2.2.1”项下方法制备供试品、对照品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样，按外标法以峰面积计算样品中主药的含量。结果，3批样品主药含量在99.33%～102.00%之间，符合要求，详见表3。

表3 CHT中主药与有关物质含量测定结果（±s，n＝6）Tab 3 Results of content determination of main component and related substance in Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablet（s±s，n＝6）

表3 CHT中主药与有关物质含量测定结果（±s，n＝6）Tab 3 Results of content determination of main component and related substance in Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablet（s±s，n＝6）

有关物质含量/%0.09±0.22 0.09±0.21 0.10±0.64批号101027 101029 101031主药含量/%102.00±1.22 101.24±1.05 99.33±1.04

2.13 样品中有关物质含量检查

取3批CHT各若干片，照“2.2.2”项下制备供试、对照液，取对照液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液20 μL进样，调节仪器灵敏度，使主成分峰高为满量程的20%；另取供试液的续滤液20 μL进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍以上。如有杂质峰，量取除溶剂峰和辅料峰以外的各杂质峰面积之和，并与对照液主成分峰面积比较，以不加校正因子的自身对照法计算杂质含量。结果，3批样品的有关物质含量均低于0.15%，符合要求，结果见表3。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

利用二极管阵列检测器对CH对照品溶液扫描，结果在215、251 nm波长处均有最大吸收；对破坏性试验（酸、碱、氧化、光照等）后的样品溶液扫描，其最大吸收波长也多在251 nm波长处。另外，由于215 nm波长接近末端吸收，基线不易平衡。根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特性，选取响应值基本一致的251 nm作为本品含量和有关物质的检测波长。

3.2 流动相的选择

《美国药典》收载的CH片的含量测定，其流动相为0.07%的Na2HPO4（pH6.0）-乙腈（75∶25）[5]。笔者自制的CHT，在此流动相下保留时间仅为3.8 min，且峰拖尾、柱效低、理论板数低于2 000。本文将Na2HPO4的浓度增加到0.17%时，柱效提高，理论板数在6 000左右；其pH值从原来的6.0调节至3.0时，峰形最好；将磷酸盐溶液与乙腈的比例从75∶25调整为85∶15，主峰的保留时间由3.8 min变为7.7min，此时主峰与溶剂及有关物质峰能完全分离。

[1]Nagashima M，Akiko O，Sanity M，et al.The clinical trials of β-blocker agent carteolol in the field of pediatrics[J].Clin Pediatr，1983，36（2）:415.

[2]刘 慧.新受体阻断剂-盐酸卡替洛尔的研究进展[J].天津药学，1992，11（1）:15.

[3]盐酸卡替洛尔片.JAPIC药品说明书[EB/OL].http://www.genome.jp/kusuri/japic_med/show/0052337.2011-06-09.

[4]罗永煌，聂延君，乔彦茹，等.盐酸卡替洛尔口腔崩解片及其制备方法[P].CN:101690720，2010-04-07.

[5]The United States Pharmacopeial Convention.USA Pharmacopoeia（USP32-NF27）.Carteolol Hydrochloride Tablets[EB/OL].http://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/usp32/pub/data/v32270/usp32nf27s0_m13670.html.2009-05-01.2011-03-26.