HPLC法测定大鼠血浆中奥拉西坦的浓度Δ

刘秀菊，张志清，杨秀岭，杜杰，郭利（.河北医科大学第二医院，石家庄050000；.河北邢台市人民医院，河北邢台 05406）

奥拉西坦（Oxiracetam）化学名为4-羟基-2-酮-1-吡咯酰胺，是一种环γ-氨基丁酸（GABA）类促智药，可促进磷酰胆碱和磷酰乙醇胺的合成，提高大脑对氧和葡萄糖的利用及三磷酸腺苷/二磷酸腺苷的比值（ATP/ADP），使大脑中蛋白质和核酸的合成增加；还能作用于谷氨酸盐促代谢受体，防止谷氨酸所致的神经毒性[1，2]。研究[3]显示，奥拉西坦可改善记忆与智能障碍患者的记忆和学习功能。已报道的奥拉西坦血药浓度测定方法，流动相制备复杂，血浆样品处理操作烦琐、成本高[4～8]。本研究拟建立大鼠血浆中奥拉西坦浓度的高效液相色谱检测方法，为奥拉西坦大鼠体内的药动学研究提供方法学参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱系统，包括515泵、486紫外检测器、Empower Application操作平台（美国Waters公司）；GL-20G-Ⅱ冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；低温冰箱（日本三洋公司）。

1.2 试药

奥拉西坦对照品（石药集团中诺药业有限公司，批号:128101207，纯度:99.60%）；奥拉西坦注射液（广东世信药业有限公司，批号:1012010，规格:1 g∶5 mL）；乙腈为色谱纯。

1.3 动物

健康SD大鼠，清洁级，♂，体重（300±10）g，由河北省实验动物中心提供，合格证号为SCXK（冀）2008-1-003。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Symmetry shiedTMRP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:乙腈-水（3.2∶96.8，V/V），流速:0.8 mL·min－1；检测波长:210 nm ；柱温:40 ℃；进样量:20 μL。

2.2 血浆样品处理

取冷冻血浆样品室温自然解冻，5 000 r·min－1离心5 min，取上清液200 μL置于带塞离心管中，加乙腈300 μL沉淀蛋白，涡旋振荡1 min，10 000 r·min－1离心5 min，取上清液20 μL进样分析。

2.3 专属性试验

奥拉西坦对照品溶液直接进样，另取空白血浆、空白血浆+奥拉西坦对照品及给药后2 h的血浆样品分别按“2.2”项下处理并测定，记录色谱。结果表明，在“2.1”项色谱条件下，奥拉西坦峰形良好，保留时间为3.65 min，大鼠血浆中内源性物质对奥拉西坦的测定无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 标准曲线的绘制

精密称取奥拉西坦对照品约100 mg，置于100 mL量瓶中，蒸馏水定容制备成浓度为1 000 mg·L－1的奥拉西坦贮备液。分别精密量取奥拉西坦贮备液适量，制备成浓度为1 000、600、400、200、100、50、20 mg·L－1的奥拉西坦对照品溶液。取上述溶液各100 μL，分别置于3 mL带塞离心管中，加入空白血浆900 μL，制成浓度为100、60、40、20、10、5、2 mg·L－1的模拟血浆样品，按“2.2”项下处理并测定。以奥拉西坦峰面积（Y）对血浆药物浓度（X）进行线性回归，得标准曲线方程Y＝13 044X－15 957（r＝0.999 8，n＝7），奥拉西坦检测浓度的线性范围为2～100 mg·L－1，最低检出浓度为0.01 mg·L－1。

2.5 回收率试验

取空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备成低、中、高（5、20、60 mg·L－1）3种浓度的奥拉西坦模拟血浆样品，按“2.2”项下处理并测定，以奥拉西坦峰面积与等量奥拉西坦对照品溶液直接进样的峰面积比，即为奥拉西坦的绝对回收率；根据标准曲线计算药物浓度，以测得药物浓度与已知药物浓度之比，计算方法回收率。结果，低、中、高浓度的模拟血浆样品的绝对回收率分别为（91.1±5.17）%、（97.9±3.22）%、（98.4±1.99）%；方法回收率分别为（96.35±3.01）%、（101.40±3.41）%、（102.23±1.37）%。

2.6 精密度试验

按“2.5”项下方法制备低、中、高3种浓度的奥拉西坦模拟血浆样品，分别放置1、2、3、4、5 h，按“2.2”项下处理并测定。同日测定5次，计算日内RSD；另每日测定1次，连续测定5 d，计算日间RSD。精密度试验结果见表1。

表1 精密度试验结果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision tes（t±s，n＝5）

表1 精密度试验结果（±s，n＝5）Tab 1 Results of precision tes（t±s，n＝5）

RSD/%3.25 3.17 3.14质量浓度/mg·L－1 5 20 60日内实测值/mg·L－1 4.88±0.14 19.41±0.85 57.74±2.04 RSD/%2.86 4.38 3.54日间实测值/mg·L－1 4.88±0.16 20.35±0.65 58.82±1.85

2.7 稳定性试验

取空白血浆，按“2.4”项下方法制备成浓度为20 mg·L－1的奥拉西坦模拟血浆样品，照“2.2”项下处理，处理时间分为即刻处理、－40℃低温保存30 d后处理、反复冻融3次后处理，然后进样测定，考察血浆样品低温保存稳定性、反复冻融稳定性；另即刻处理后，分别放置0、1、2、3、4 h后进样测定，考察血浆样品处理后放置稳定性。结果表明，奥拉西坦血浆样品低温保存稳定性、反复冻融稳定性均良好，血浆样品处理后放置4 h稳定性良好。

2.8 血浆样品的测定

取奥拉西坦注射液1支（1 g∶5 mL），置于25 mL量瓶中，蒸馏水定容，制备成浓度为40 mg·mL－1的奥拉西坦溶液（临用现配）。取大鼠8只，禁食不进水12 h后，按人临床常用剂量换算200 mg·kg－1的剂量一次性灌胃给予奥拉西坦溶液1.5 mL，分别于给药前和给药后2 h眼内眦取血0.5 mL，置于肝素钠抗凝的带盖塑料离心管中，3 000 r·min－1离心5 min，取上层血浆，－40℃冰箱保存待测。冷冻血浆样品按“2.2”项下处理并测定。结果，8只大鼠血浆样品中奥拉西坦浓度分别为38.16、20.05、38.52、27.28、30.65、41.91、56.04、32.00 mg·L－1，平均浓度为（35.58±10.83）mg·L－1。

3 讨论

奥拉西坦是一种极性很强的小分子物质，水溶性很强，而在有机溶剂中的分配系数很小，很难用有机溶剂从生物样品中提取分离出来供高效液相色谱分析[5，6]。本实验采用耐水的Waters C18反相色谱柱，调整流动相的组成，增加流动性中极性成分的比例并降低流速，使待测物的保留时间维持在3.65 min，与血浆内源性物质分离完全。

本研究选择检测波长为210 nm，该波长下，大多数脂溶性高、极性较弱的药物不易检测，而对极性较大的奥拉西坦则较为适宜。进行反相高效液相色谱分析时，最常采用甲醇作为流动相的主要成分，但其紫外截止波长为205 nm，与210 nm接近，故本实验采用乙腈作为流动相[7]。

本研究结果显示，本方法简便、准确、灵敏度高、重现性好，可用于大鼠血浆中奥拉西坦浓度的测定。

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