Lactobacillus plantarum LY-78产苯乳酸发酵培养基优化的研究

李士龙，陈明霞，3，田雪娇，张丽萍，2

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319；2.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心；3.大庆油田技术培训中心）

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）即2-羟基-3-苯基丙酸[1]，是近年来人们发现的乳酸菌代谢产生的一种新型抑菌物质，抑菌谱广，具有较好溶解性、热稳定性[2]。苯乳酸可由多种微生物产生，早期研究的是乳糖发酵短杆菌[3]，近几年研究的主要有乳酸菌，霉菌[4]，溶血葡萄球菌[5]等，但是这些菌株的苯乳酸产量很低。Lavermicocca（2000年）[6]从酸面团中分离到的L.plantarum 21B，产苯乳酸量为0.056 g·L-1，这是关于乳酸菌产生苯乳酸的首次报道，随后相继获得多株乳酸菌，但产苯乳酸的菌株间差异较大，最高为0.099 g·L-1。张莉力[7]、柴虹宇[8]等人从传统发酵制品中分离得到苯乳酸产量为0.081 g·L-1的植物乳杆菌，通过紫外线诱变后，苯乳酸产量达到0.528 g·L-1。李兴峰（2007年）[9-10]等从中国传统食品泡菜中，筛选得到一株植物乳杆菌SK007，苯乳酸的产量可达0.091 g·L-1，在MRS培养基中，30℃发酵培养基下，3 g·L-1苯丙酮酸24 h后转化生成2.1 g·L-1左右的苯乳酸，此为目前世界上乳酸菌中产苯乳酸量最高的菌株。由此可知，苯乳酸生产菌及其生产能力还有挖掘潜力，要实现工业化生产苯乳酸，必须要有高产苯乳酸的菌种。试验以筛选自本国、本地区的自然发酵物中的高产苯乳酸菌株Lactobacillus plantarum LY-78（苯乳酸初始产量为0.246 g·L-1）为出发菌株，对其发酵培养基进行优化，以便为工业化生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

Lactobacillus plantarum LY-78（GenBank数据库登陆号JN222930），由课题组筛选保存。

1.1.2 基础培养基

酵母粉5 g·L-1，牛肉膏10 g·L-1，葡萄糖5 g·L-1，磷酸氢二钾2 g·L-1，乙酸钠5 g·L-1，吐温-80 8mL·L-1，磷酸氢二钾 2 g·L-1，乙酸钠5 g·L-1，柠檬酸二铵2 g·L-1，硫酸镁0.58 g·L-1，硫酸锰0.25 g·L-1，pH调至6.2～6.4。

1.1.3 主要仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（Agilent科技公司），BCN-1360型超净工作台（北京东联哈尔仪器有限公司），SPH-250型生化培养箱（上海森信试验仪器有限公司），TGL-16B型高速离心机（江苏省金坛市医疗仪器厂），HZQ-QX全温振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）。苯乳酸标品（Sigma公司），其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 苯乳酸含量测定方法

取发酵液10mL，加20mL无水乙醇，5 000 r·min-1离心15min，取上清液，95℃水浴40 min，分别用10mL乙醚常温萃取2次，合并2次萃取液，50℃蒸干，用甲醇溶解定容至10mL，冰箱冷藏备用[7]。

采用沐万孟等[11]的方法进行苯乳酸含量测定。流动相A为0.5 g·L-1三氟乙酸水溶液，B为乙腈溶液；洗脱程序是0～20min为10%～100%B，20～23 min保持100%B；检测波长为210 nm；柱温30℃；流速1 mL；进样量10μL。

1.2.2 培养条件优化试验设计

1.2.2.1 Plackett-Burman试验设计筛选影响苯乳酸产量的关键因子

以Lactobacillus plantarum LY-78为出发菌株，采用优化后的发酵培养基，即发酵时间74 h，接种量7%，发酵温度35℃，pH 8，摇床转速150 r·min-1，装液量150 mL/250 mL，种龄10 h，以苯乳酸的产量作为响应值Y，对发酵培养基进行优化。通过Plackett-Burman试验设计[12]，选择培养条件中的7个因素作为研究对象，即酵母膏（X1）、葡萄糖（X2）、蛋白胨（X4）、碳酸钙（X6）、苯丙氨酸（X7）、牛肉膏（X8）、和吐温-80（X9），另外选择2个虚拟变量，用来估算误差。试验选用9因素，N=12次的试验表格，筛选出3个主效应影响因子。

1.2.2.2 最陡爬坡试验设计逼近关键因素的最优水平

根据Plackett-Bunnan试验确定的3个重要因素设计最陡爬坡试验，检测苯乳酸含量，以确定响应面试验的中心试验点。

1.2.2.3 Box-Benhnken试验设计结合响应面法优化发酵培养基

在Plackett-Burman试验的基础上，选择影响合成苯乳酸的3个主要因素为自变量，以苯乳酸产量为考察指标，采用Box-Benhnken试验设计，进行三因素三水平试验，以确定最优培养条件。

1.2.2.4 统计分析方法

采用SAS8.2软件对所得数据进行回归和图形分析。

2 结果与分析

2.1 苯乳酸产量影响因子的评价

按照表1给出的变量取值，通过 Plackett-Burman试验设计进行发酵，对试验结果利用SAS软件进行分析，显示结果见表1。

Plackett-Burman试验设计法是一种两水平的试验设计方法，它可以在多个因素中快速选出最重要的几个因素。每个因素取两个水平：低水平记为-1，高水平取低水平的1.25倍左右，记为1[13-15]。由表可知，葡萄糖、苯丙氨酸、吐温-80添加量在7个考察因素中显著性最高。葡萄糖是用来构成细胞物质或代谢产物中碳架来源的营养物质，为机体提供维持生命活动所需的能源，是微生物生长需要量最大的营养物；苯丙氨酸是合成苯乳酸的前体物质，苯丙氨酸在转氨酶的作用下生成苯丙酮酸，进一步在脱氢酶的作用下生成苯乳酸；表面活性剂吐温-80可以刺激苯乳酸的产生，帮助苯乳酸很好的扩散，这或许是由于吐温-80起了阻止苯乳酸吸附到细胞表面和玻璃器皿表面的作用。所以选这3个因素作为重要因素，进行进一步的优化。另外4个因素根据效应性选择试验水平，即蛋白胨（X3）选择低水平，酵母膏（X1）、牛肉膏（X8）、碳酸钙（X5）选择高水平。

使用SAS软件对数据进行拟合，主要因素的编码多元一次回归方程为：

一次多项式拟合的相关系数R2值为97.25%，回归模型相关度也较为显著（p＜0.05）。这些结果表明该模型解释了Plackett-Burman试验中97.25%的数据。

表1 Plackett-Burman试验设计方案及结果Table 1 Plackett-Burman experimental design plan and results

表2 最陡爬坡试验设计Table 2 Steepestascentexperimental design

2.2 最陡爬坡试验结果

通过Plackett-Burman试验找到显著因素分别为葡萄糖、苯丙氨酸和吐温-80，且葡萄糖和酵母膏为正效应，吐温-80为负效应。根据试验结果所显示的正负效应确定因素水平增加或减少，结合试验的实际情况，设计三个因素的变化方向和步长。以葡萄糖每次增加5 g、苯丙氨酸每次增加2 g、吐温-80每次减少1mL为基本步长，最陡爬坡试验设计见表2。找到苯乳酸产量最大的试验处理，即为响应面分析法的中心点。

由表4可知，最优发酵培养基在No.3和No.5之间，所以用No.4条件作为响应面优化试验的中心点。

2.3 Box-Benhnken中心组合试验及分析

2.3.1 响应曲面模型的建立及回归分析检验

以Plackett-Burman设计的结果为基础，结合最陡爬坡试验结果，以苯乳酸产量为响应值Y，选取第4组的添加量作为响应面试验设计的零水平，对葡萄糖、苯丙氨酸和吐温-80这3个因素运用响应面法来优化，试验因子的编码值、试验安排和结果见表3。

15个试验点可分为两类：一是析因点，自变量取值在其所构成的三维顶点，共12个析因点；二是零点，为区域的中心点，用以估算试验误差[16-18]。以苯乳酸的产量为响应值，利用SAS软件对表3的数据进行回归分析，得到关于苯乳酸产量（Y）对发酵时间（X1）、接种量（X2）、发酵温度（X3）的多元回归方程：

表3 中心组合设计试验的方案及结果Table 3 The test program and results of central composite design

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regressionmodel

从方差分析结果可以看出，此试验得到的模型回归显著性p＜0.01，试验选用的二次多项模型具有高度显著性，失拟项p＞0.05，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项，模型适当。用以评价回归模型拟合度的R2值为96.08%，说明苯乳酸产量的实测值和预测值具有较高的拟合度，试验的误差较小，方程代表的模型适合于模拟此发酵过程，可以用于试验结果的分析和预测。

表5 响应面二次多项式方差分析结果Table 5 Quadratic polynomial response surface analysis of variance results

2.3.2 发酵培养基的响应面分析及条件优化

图1 Y=f（X2，X3）的响应面和等高线分析图Fig.1 Y=f（X2，X3），response surface and contour analysis diagram

图1是由多元回归方程式所做的响应曲面图及其等高线图，由此可对X2，X3两因素交互影响进行分析与评价，以确定最佳因素水平范围。显示了当葡萄糖添加量处于中心点水平值20 g·L-1时，苯丙氨酸添加量和吐温-80添加量对苯乳酸产量的交互作用影响，由图可直观看出两者的交互作用比较显著，此结果与方差分析相一致。当苯丙氨酸添加量于较低或较高值时，吐温-80添加量的增加对其抑菌活性的影响不大，但当苯丙氨酸添加量位于13 g·L-1附近时，随着吐温-80添加量的增加，苯乳酸产量快速增加，并在一定范围内达到最大值，两者变现出一定的协同作用，但超出了一定范围，苯乳酸产量则呈现负增长势态。这同时也说明苯丙氨酸添加量对响应值影响十分显著。

由图1可知，该回归方程存在极大值点。该组图对X2，X3两个主效应因子对苯乳酸产量的交互作用进行了评价。根据回归方程，可得到最佳因素编码：X1=23.981 4，X2=12.991 19，X3=7.403 544，最佳点时的Y值为2.222 674。考虑到实际情况即葡萄糖添加量为24 g·L-1，苯丙氨酸添加量为13 g·L-1，吐温-80添加量为7.4mL·L-1，苯乳酸产量理论值为2.22 g·L-1。

为检验试验的可靠性，采用上述最佳发酵培养基进行苯乳酸发酵试验，经过5次重复试验，实际得到的苯乳酸产量的平均值为2.13 g·L-1，与理论预测值2.22 g·L-1的相对误差小于5%，说明该方程与实际情况拟合良好，响应面分析所得到的优化模型是可靠的，表明该数学模型对优化苯乳酸发酵工艺条件是可行的，可真实的反应各因素对苯乳酸产量的影响，具有实用价值。

3 讨论

发酵培养基的变化对产苯乳酸的菌株有很大的影响[10，13，16]，因此，对苯乳酸发酵培养条件进行优化具有重要的意义。Plackett-Burman试验设计法基于不完全平衡块原理，可以利用最少的试验次数，从众多的考察因素中快速有效地筛选出主要的影响因子；Box-Behnken设计法在先逼近最大响应区域后建立连续变量曲面模型和回归方程，并能对影响因变量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价，可快速有效地确定多因素系统的最佳条件[19-21]，综合运用两种方法对Lactobacillus plantarum LY-78发酵培养基进行研究，结果表明在各因素分别为葡萄糖24 g·L-1，苯丙氨酸13 g·L-1，吐温-80 7.4 mL·L-1、酵母膏6.25 g·L-1、牛肉膏12.5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、碳酸钙12.5 g·L-1，培养基其他成分不变时，5次验证试验苯乳酸产量2.13 g·L-1，与未优化前的0.246 g·L-1相比，产量提高了7.65倍。

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