猪轮状病毒性腹泻及继发感染的诊断

靳明武，张洋龙，涂飞，邵光喜，周玉龙，倪宏波

（1.黑龙江农垦总局九三管理局畜牧兽医局，嫩江161441；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）

近年来，随着养殖规模的不断扩大，猪病多以病原的多重感染或混合感染为主要的流行形式，猪群发病往往不是由单一病原所致，而是以两种以上的病原体相互协同作用所造成的。这样常常导致猪群的高发病率和高死亡率，危害极其严重，而且控制难度大[1]。仔猪轮状病毒性腹泻是由猪轮状病毒引起的急性肠道传染病，是危害养猪业的主要疾病之一。轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是各种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一[2-3]。猪轮状病毒感染是主要以仔猪厌食、呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为特征性症状的疾病[4]。1968年美国的Mebus等首次从犊牛粪便中分离出轮状病毒[5]，1973年澳大利亚学者Bishop，在胃肠炎患者的十二指肠超薄切片中也发现轮状病毒，该病毒是引起婴儿及多种幼龄动物非菌性腹泻的主要病原[6]。目前，该病在我国和世界各养猪国家普遍存在，其造成的直接或间接经济损失也非常巨大。

2012年4月，北京市大兴区某猪场发病，根据其临床症状和剖解变化怀疑有轮状病毒感染，采集肝、脾、肠、肾、淋巴结等病料进行实验室诊断，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

北京一猪场送来一只病死仔猪，无菌采集其肝、脾、肠、肾、淋巴结等。

1.1.2 试剂

Marker DL 2000购自大连宝生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取盒购自TIANGEN公司，PCR Master Mix缓冲液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒购自QIAGEN公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录盒购自MBI公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 引物设计

根据GenBank中已发表的猪巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒、猪瘟病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒基因序列设计特异引物。猪巴氏杆菌：F5′-AGGGCACGCAGGCGGACTTTTA-3′，R5′-ATCGACAGCGTTTACAGCGTGGA-3′；猪链球菌：F5′-GATAGATGACGGTTCTTCAGATT-3′，R5′-TCCTCT CCTAACCACTGTTCAG-3′；副猪嗜血杆菌F5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，R5′-GGCTTCGTC ACCCTCTCTGT-3′；胸膜肺炎放线杆菌F5′-AAGGTT GATATGTCCGCACC-3′，R5′-CACCGATTACGCCTTG CCA-3′；猪繁殖与呼吸系统综合征病毒 F5′-GCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGG-3′，R5′-GCGT CGGCAAACTAAACTCCACAG-3′；猪瘟病毒 F5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′，R5′-TGATGCTGT CACACAGGTGAA-3′；传染性胃肠炎病毒 F5′-CAACCCTGAAACTAACGCAATTCT-3′，R5′-GCCCAT CCAGTCGCACTACTT-3′；流行性腹泻病毒 F5′-AGGAACGTGACCTYAAAGACATCCC-3′，R5′-CCAG GATAAGCCGGTCTAACATTG-3′；轮状病毒 F5′-AAATCCGCAACTATACTGTGACTA-3′，R5′-AAATC CGCAACTATACTGTGACTA-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离鉴定

1.2.1.1 细菌分离纯化

无菌剪取一小块深部组织脏器，分别接种涂抹于营养琼脂培养基和5%血琼脂培养基上，分别做需氧和厌氧培养，置37℃恒温箱中24 h，观察菌落形态和溶血情况等。挑取疑似菌的单个菌落进行纯培养，划线于5%兔血琼脂培养基，37℃恒温箱中需氧培养24 h。

1.2.1.2 革兰氏染色

利用革兰氏染色技术在油镜下观察细菌的形态及颜色，紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。

1.2.1.3 细菌DNA粗提取

挑取各个不同形态、大小、颜色的菌落悬浮于含100μL超纯水的1.5 mL离心管中，震荡混匀，煮沸10 min后置于冰上冷却2 min，12 000 r·min-1离心2 min，取上清液作为PCR反应的粗制DNA模板，置-20℃保存。

1.2.2 病毒鉴定

剪取该病例的心、肝、脾、肺、肾、肠、淋巴结各一小块，用组织研磨器研磨后，用生理盐水重悬。然后进行以下操作：

1.2.2.1 组织DNA提取：按照TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取盒（购自TIANGEN公司）上面的步骤说明进行操作。

1.2.2.2 组织 RNA提取：按照 RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒（购自QIAGEN公司）上面的步骤说明进行操作。

1.2.2.3 RNA反转录：按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录盒（购自MBI公司）上面的步骤说明进行操作。

1.2.3 PCR扩增

以实验室分离得到的DNA和cDNA为模板，猪巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、轮状病毒、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒的特异性引物为引物进行PCR反应扩增，扩增体系如下：PCR Master Mix12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板DNA1μL，加去离子水补至25μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火30 s（巴氏杆菌56.5℃，猪链球菌54℃，副猪嗜血杆菌60℃，胸膜肺炎放线杆菌60℃，猪繁殖与呼吸系统综合征病毒57℃，圆环病毒52℃，猪瘟病毒60℃，传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、轮状病毒三重PCR退火温度51℃），72℃延伸30 s，30个循环，最后72℃终延伸10min。

1.2.4 PCR产物检测

取5μL扩增产物加入点样孔，以165 V电压进行1%琼脂糖凝胶（含1%溴化乙锭2μL）电泳。电泳液用1×TAE缓冲液。25min后在紫外灯下观察扩增结果，并一次成像拍照。

2 结果与分析

2.1 临床症状

患病猪病初食欲不振，精神沉郁，出现呕吐和腹泻，粪便成水样、糊状或似乳清样液体，粪便呈黄绿色、灰白色或黑褐色，下痢病猪出现严重的脱水和体重下降。

2.2 病理学诊断

病变主要限于消化道，胃弛缓，内充满凝乳块和乳汁，小肠壁变薄，呈半透明状，肠内容物呈浆性或水样，灰白或灰黑色，肠系膜淋巴结水肿，胆囊肿大，肠绒毛萎缩。

2.3 实验室诊断

2.3.1 细菌的分离

从肝、脾、肺、肾、肠、淋巴结组织中分离的各得到两种细菌，根据菌落形态、大小以及颜色等初步确定有三种细菌感染，其中一种在血平板菌落较大，呈小水滴一样，无溶血现象，菌落为黏液型，略带荧光；另一种菌落在血平板上位针尖般大小，呈β溶血，菌落颜色为类白色；还有一种在血平板上菌落呈圆形，较大，表面光滑、湿润，灰白色。将三种菌落接种到麦克凯培养基上，第一种和第二种菌落均不生长，第三种菌落在麦克凯培养基上形成红色菌落。再进一步将第三种菌接种到伊红美蓝培养基上，可见黑色带金属光泽的菌落。由此可确定第三种菌为大肠杆菌。

2.3.2 革兰氏染色

将分离纯化的细菌进行革兰氏染色、涂片、镜检。可见第一种菌两端钝圆红色杆状菌，两极着色，无鞭毛，不形成芽胞，大小约为0.25 um～0.4 um× 0.5 um～2.5 um革兰氏阴性菌；第二种菌也是一种两极着色的红色短杆菌，有荚膜和鞭毛，具有运动型。第三种菌红色短杆菌，两端钝圆，散在或成对分布，有鞭毛，无芽胞，大小约为0.4 um～0.7 um×2 um～3 um革兰氏阴性。

2.3.3 PCR

2.3.3.1 细菌PCR

对纯培养的细菌做菌落PCR，分别选用放线杆菌、巴氏杆菌的特异性引物，对细菌进行PCR鉴定。PCR结果经琼脂糖凝胶电泳分析，结果发现1号泳道有一条约450 bp的特异条带，与放线杆菌预期目的片段大小相符；3号泳道有一条约250 bp的特异条带，与巴氏杆菌预期目的片段相符（如图1）。

2.3.3.2 病毒PCR

以组织中提取的病毒DNA以及病毒RNA反转录的cDNA为模板，选用轮状病毒的特异性引物，对病毒进行PCR鉴定。PCR结果经琼脂糖凝胶电泳分析，结果发现1号泳道有一条约400 bp的特异条带，与轮状病毒预期目的片段大小相符（如图2）。

图1 细菌PCR结果Fig.1 The results of bacterial PCR

图2 病毒PCR结果Fig.2 The results of Virus PCR

3 讨论

通过对该猪场的病料进行的病原学检测和病原的分离与鉴定，和PCR等实验结果表明，该猪场送检的病死猪感染了轮状病毒、大肠杆菌、巴氏杆菌、放线杆菌病。由于该病例送检前主要表现出的是消化道症状，因此，在剖检时，我们主要观察的也是消化道方面的病理变化，但在肺脏等器官并无明显的病理变化。且实验室采取的是无菌剖检，并在分离时也是采取的无菌操作，因此断定放线杆菌和巴氏杆菌是该病例本身所带菌，但还未致病或还未表现出明显的症状和病理变化。另外，还对大肠杆菌进行了致病性实验，将分离到的大肠杆菌腹腔注射到小鼠体内，小鼠大面积死亡，因此，判定该种大肠杆菌为致病性大肠杆菌。

猪轮状病毒感染也是仔猪腹泻的重要原因之一，轮状病毒主要存在于病猪及带毒猪的消化道内，病猪排出粪便污染饲料、饮水和各种用具，成为本病传染的重要因素。轮状病毒本病多发生在晚秋、冬季和早春季节，应激因素，特别是寒冷、潮湿、不良的卫生生条件，对该病的严重程度和病死率均有较大影响，加强饲养管理，保持栏舍清洁卫生，可减少环境中的病毒含量，也可以防止一些病毒和细菌的继发感染，减少发病的机会。然而猪的放线杆菌感染经常被猪场所忽视，猪放线杆菌可引起猪的败血症和死亡，猪放线杆菌属于条件性致病菌，常存在于健康猪的扁桃体和上呼吸道，主要通过损伤的黏膜或皮肤感染。对于猪巴氏杆菌，因为一定程度上是一种条件性致病菌，平时严格的饲养管理非常重要，合理搭配日粮、营养平衡，注意通风、保暖，干燥、减少应激，增强抵抗力非常关键[7-8]。

因此，总的来说，猪场控制该类疾病，首先应该加强饲养管理制度，保持猪舍温暖、干燥、通风、清洁，经常对猪圈消毒，加强光照、降低猪舍湿度、注意防寒保暖，增强母猪和仔猪的抵抗力，产子后，尽量使仔猪及早吃到初乳，因为初乳和乳汁中含有一定量的保护性抗体，仔猪吃到初乳后可获得一定的抵抗力，能减少发病和减轻发病症状。实行全进全出的管理模式，坚持自繁自养不从疫区购猪，新引进猪隔离观察1个月后健康，方可合群。进行预防接种，每年定期进行有计划免疫注射。发现病猪立即隔离到清洁、消毒、干燥和温暖的猪舍中。其次应该对原来的免疫程序不断的探索和改进，找出一个最适合的免疫程序按时、按质做好猪的免疫注射工作。最后，防制上应树立“防重于治、养重于防、养防结合”的观念，采取环境控制、管理，疫苗和药物预防相结合的综合防控措施，控制疾病的发生，切实做好疾病防疫工作，规范制度，定期消毒和免疫接种对这些病将起到很好的控制作用。

［1］王永辉.规模化猪场管理中存在的问题及建议［J］.今日畜牧兽医，2011，（4）：18-20.

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［3］Wills RW.Diarrhea in growing-finishing swine［J］.Vet Clin North Am Food Anim Pract.，2000，16（1）：135-161.

［4］Ziemer CJ，Bonner JM，Cole D，et al.Fate and transport of zoonotic，bacterial，viral，and parasitic pathogens during swine manure treatment，storage，and land application［J］.J Anim Sci.，2010，88（13）：84-94.

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［6］Meloni A，Locci D，Frau G，et al.Epidemiology and prevention of rotavirus infection：an underestimated issue［J］.JMatern Fetal NeonatalMed.，2011（2）：48-51.

［7］梁晓芹，宋永阁.猪肺疫的临床及综合防制［J］.农村实用科技信息，2009（4）：38.

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