重组干酪乳杆菌代谢产物抑菌效果的研究

谭君，侯喜林，余丽芸，2，李剑华，王桂华，曹宁

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院；3.大庆油田总医院）

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）是人体和动物肠道中一种正常的益生菌，被公认为安全级（generally recognized as safe，GRAS）微生物[1]，具有多种生理功能，如控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能。因此，干酪乳杆菌可作为安全的口服疫苗和其他病原体的抗原载体[2-5]。乳杆菌在肠道达到一定数量时，可以抑制肠道中及自然界中某些有害微生物的生长。益生菌的一个重要性质指标是对病原菌的抑菌活力[5]。因此实验对表达产肠毒素性大肠埃希氏菌K88抗原的重组基因工程乳酸菌的抑菌性能进行研究，为其口服疫苗的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种：重组K88干酪乳杆菌由黑龙江八一农垦大学基因工程实验室构建并保存；指示菌：猪源金黄色葡萄球菌（S.aureus）由黑龙江八一农垦大学预防兽医学实验室保存，产肠毒素性大肠埃希氏菌（Enterotoxigenetic E.coli，ETEC）C83902株购自中国兽药监察所。

培养基：MRS培养基用于培养乳酸菌；牛肉膏蛋白胨培养基用于培养指示菌。

1.2 乳酸菌上清液的制备

将重组K88干酪乳杆菌接种于液体MRS培养基中，37℃静置培养36 h后，8 000 r·min-1离心10 min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌收集上清液，保存于4℃冰箱中备用。

1.3 检测平板的制备

将2种致病菌原菌种接种于肉汤培养基中，37℃恒温箱培养12 h后，用无菌生理盐水稀释成致病菌菌液备用，浓度约为105CFU·mL-1。用微量移液枪取致病菌液0.1mL置于制备好的营养琼脂检测平板内，用无菌玻耙将指示菌液在平板上涂布均匀，37℃恒温干燥20min以固定菌液，使菌液渗入培养基表层内，取出后即可进行抑菌试验。

1.4 发酵上清液抑菌的检测

采用牛津杯法做抑菌试验[6]。用镊子夹取无菌牛津杯轻轻放入检测平板培养皿中，在水平放置的平皿中均匀放置4只牛津杯。吸取乳酸菌上清液0.2mL至牛津杯中（注意不要将上清液溢出杯外）。每种致病菌分别做3个重复样，1个对照样，对照样只加液体MRS。然后将加好上清液的培养皿正面放置37℃恒温培养箱中培养24 h，观察抑菌圈，测抑菌圈直径。

1.5 不同pH值对上清液的抑菌效果

用稀盐酸、氢氧化钠溶液调乳酸菌上清液pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，37℃恒温培养24 h，观察不同pH值下的抑菌效果，取3次平行测定的平均值。同时设乳酸作对照。

1.6 加热后上清液的抑菌效果

将乳酸菌上清液水浴加热到100℃保持15 min用于抑菌实验，37℃恒温培养24 h，观察加热后上清液抑菌效果，取3次平行测定的平均值。以未经热处理的上清液为对照。

1.7 胃蛋白酶处理后上清液的抑菌效果

检测胃蛋白酶处理后上清液的抑菌效果[7]。将乳酸菌上清液分装于 eppendorf管中（5 mL上清液/管），用无菌水将胃蛋白酶配成10%的溶液（酶的活力单位1∶250），按1mg·mL-1酶的量取50μL酶溶液，用加样器加入装有乳酸菌发酵上清液的eppendorf管中，混匀，37℃恒温静止孵育2 h后，进行抑菌实验。观察经胃蛋白酶处理后发酵液的抑菌效果，取3次平行测定的平均值。对照组加入等量的未经蛋白酶处理的上清液。

2 结果与分析

2.1 干酪乳杆菌发酵液的抑菌效果

通过实验观察到乳酸菌上清液对ETEC（图1）和S.aureus（图2）均有明显的抑菌效果，且抑菌圈大小均在15mm以上。测量所得到抑菌圈大小的实验结果（见表1）。

2.2 不同pH值对上清液抑菌效果的影响

不同pH值对乳酸菌代谢产物抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果具有明显影响，pH值越低，乳酸菌代谢产物的抑菌效果越好；当pH为2.0时抑菌最明显，随着pH的升高抑菌作用逐渐减弱。在pH为5.0时，乳酸菌代谢产物失去了抑菌活力（见表2）。

图1 发酵液对产肠毒素大肠杆菌的抑菌效果Fig.1 Bacteriostasis effect of fermentation broth on ETEC

图2 发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Fig.2 Bacteriostasis effect of fermentation broth on S.aureus.

表1 发酵液对致病菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostasis effect of fermentation broth on pathogenic bacteria

表2 不同pH条件下发酵上清液对致病菌的抑菌效果Table 2 Bacteriostasis effect of supernate on pathogenic bacteria under different pH

2.3 加热后上清液抑菌效果的影响

经热处理后培养基上产生的抑菌圈大小和对照组相比发现抑菌圈变化不明显，由此表明乳酸菌代谢产物中的抑菌活性物质的热稳定性较好（见表3）。

表3 加热后上清液的抑菌效果Table 3 Bacteriostasis effectof supernate after heating treatment

2.4 蛋白酶处理后上清液抑菌效果的影响

经胃蛋白酶溶液作用后，乳酸菌上清液的抑菌圈直径也未发生明显改变。可见抑菌活性物质对蛋白酶不敏感，即酶不能破坏抑菌物质的活性（见表4）。

表4 酶处理后上清液的抑菌效果Table4 Bacteriostasis effectof supernate after pepsin treatment

3 讨论

试验以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为抑菌试验的指示菌，不仅因为它们是导致禽畜患病的病原菌，而且它们分别是常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表。乳酸菌代谢产物的抑菌活性是多方面的，主要由有机酸、细菌素等物质发挥作用[8]。试验采用牛津杯法，研究干酪乳杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑制效果。结果表明，干酪乳杆菌代谢产物对2种菌株均具有很强的抑制作用。李南薇[9]等研究了不同pH值对乳酸菌代谢产物抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果，结果表明pH值对乳酸菌代谢产物的抑菌能力具有明显影响，pH值越低，乳酸菌代谢产物的抑菌效果越好。实验研究也发现pH值对乳酸菌代谢产物的抑菌能力具有明显影响，pH值越低，乳酸菌代谢产物的抑菌能力越强。这可能是由于在较低的pH值条件下，酸性物质大量积累，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长繁殖受到抑制。大量研究表明，乳杆菌可以在动物肠道内正常定植，通过代谢产生有机酸（主要是乳酸），降低肠道内的pH和氧化还原电势，使肠道处于酸性环境，从而抑制病原性细菌如致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等的生长[10-13]。实验同时用乳酸做对照实验，从结果可知，当对照液pH值为2.0、3.0时，产生的抑菌圈明显小于离心上清液相同pH产生的抑菌圈，这样排除了单是酸产生抑菌的可能性。说明对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用是由pH值本身和乳酸菌代谢产物共同作用造成的。杨颖[14]等用胃蛋白酶和100℃水浴加热20min处理提取的抑菌物质，发现依然保持较高的抑菌活力。实验的乳酸菌发酵上清液经加热、酶处理后的抑菌试验结果表明，抑菌圈变化不明显，乳酸菌代谢产物具有良好的热稳定性且抑菌活性物质对蛋白酶不敏感。

ETEC K88基因工程乳酸菌有望成为预防仔猪腹泻的新型口服疫苗，其本身能够产生的代谢产物对肠道致病菌有抑制作用，因此，采用该菌饲喂仔猪除了可以发挥其疫苗的功效，可以调整肠道微生物菌群的平衡，从而充分发挥其促进健康的功效。

［1］Lee Y K，Nomoto K，Salminen S，et al.Handbook of probiotics［M］.New York：John Wiley，1999.

［2］Wei CH，Liu JK，Hou XL，et al.Immunogenicity and protective ef cacy of orally or intranasally administ recombinant Lactobacillus casei expressing ETEC K99［J］.Vaccive，2010，28：4113-4118.

［3］Liu JK，Hou XL，Wei CH，et al.Induction of immune responses in mice after oral immunization with recombinant Lactobacillus casei strains expressing enterotoxigenic Escherichia coli F41 fimbrial protein［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75（13）：4491-4497.

［4］余丽芸，赵志刚，侯喜林.乳酸菌表面展示表达PEDVS1蛋白的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2008，20（4）：45-47.

［5］Hou XL，Yu LY，Liu JZ，et al.Surface dispalyed porcine epidemic diarrhea viral（PEDV）antigens on lactic acid bacteria［J］.Vaccine，2007，26：24-31.

［6］Velitchka Goteheva，Eli Hristozova，Tsonka Hristozova，et al.Assessment of Potential Probiotic Properties of Lactie Acid Bacteria and Yeast Strains［J］.Food Biotechnology，2002，16（3）：211-225.

［7］陈世琼，李平兰，张篪.猪源产细菌素乳酸菌的抑菌产物特性研究［J］.中国微生态学杂志，2001，13（4）：190-192.

［8］王小红，谢笔钧，史贤明，等.乳酸菌对金黄色葡萄球菌生物拮抗作用的初步研究［J］.食品工业科技，2005，26（1）：68-70.

［9］李南薇，李宁.乳酸菌代谢产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制作用的研究［J］.中国酿造，2009（5）：49-52.

［10］李铁军，李爱云，张晓峰.乳酸菌抗菌机理研究进展［J］.微生物学通报，2002，29：81-85.

［11］Ehnnann M A，Kurzak P，Baner J，et al.Characterization of Lactobaeilli towards their use as probiotic adjuncts in poultry［J］.Journal of Applied Microbiology，2002，92：966-975.

［12］Ogawa M，Shimizu K，Nomoto K，et al.Inhibition of invitro growth of shiga toxin-produeing Eseheriehia coli0157：H7 by probiotic Lactobaeillus strains due to production of laetie acid［J］.International Journal of food Microbiology，2001，68：135-140.

［13］Jin LZ，Marquardt R R，Baidoo S K.Inhibition of enterotoxigenic Eseherichia coli K88，K99 and 987P by the Lactobacillus isolates from porcine in testine［J］.Journal of the Science of food Agriculture，2000，80：619-624.

［14］杨颖，陈卫，田丰伟，等.产抑菌物质乳杆菌的筛选及性质的研究［J］.工业微生物，2006，36（3）：13-17.