LAMP技术诊断猪支原体肺炎的应用研究

夏伟，李鹏

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319；2.哈尔滨维科生物技术开发公司）

猪气喘病又称为猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae of swine，MPS），它是由肺炎支原体（Mycopl asma hy op neumoni ae，Mhp）引起的一种慢性接触性呼吸道传染病[1]。我国已将该病列入二类动物疫病。Mhp可通过空气传染，很难隔离和阻断传播途径，且猪群的感染率很高。Mhp感染猪后，引起猪呼吸道上皮纤毛细胞的脱落，成为诱导疾病，特别是其他免疫缺陷性疾病发生的重要因子，从而使得疫苗的免疫效力减弱或引起免疫失败，在全世界流行十分广泛，是危害养猪业最严重的疾病，给养猪业造成严重经济损失[2]。

目前猪支原体体外分离培养和鉴定具有一定的困难，所以在发展中国家及我国临床条件有限的地区建立一种简单、快速的诊断方法就尤为重要[3]，虽然现在该病有很多诊断方法，但是都需要较高的实验室条件，因此在临床上建立一种简单、快速的诊断方法具有重要实践意义[3]。2000年，Notomi等[4]提出的一种新的核酸扩增技术——环介导等温扩增（LAMP），它是一种通过设计四条特异性引物来鉴定目的基因的方法，而且它还是一种快速、简便、准确和廉价的基因扩增法，在全世界很多发展中国家和临床条件有限的地方被广泛的应用。研究主要应用建立的猪肺炎支原体LAMP诊断方法[5]对从黑龙江省多个地区养猪场所采集的患猪呼吸道病的肺脏病料和健康猪鼻拭子进行检测，试图了解该法在猪支原体肺炎临床诊断中的可行性，了解黑龙江省主要养猪密集地区的猪支原体肺炎发病情况，并进一步分析其流行病学规律，为黑龙江猪呼吸道病防治提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

Bst DNA聚合酶购自NEB生物技术有限公司；LA taq酶、dNTP+、DNA Marker 2000、pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司；凝胶回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒，加拿大BBI公司产品，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 待检病料处理和模板DNA提取

待检病料是从黑龙江省不同地区多个养猪场采集或送检的患呼吸道病猪肺脏病料及健康猪鼻拭子等。待检猪的肺脏置于-20℃保存。将TE缓冲液按1∶10加入组织中，研磨成悬液，装入灭菌的1.5mL Effendorf管中，于-20℃反复冻融三次，在高速冷冻离心机上，以3 000 r·min-1，离心10min，取上清250μL备用。鼻拭子以0.5mL缓冲液洗下，加0.5%SDS及0.2 g·L-1蛋白酶K，55℃水浴2 h，酚：氯仿抽提，冷乙醇沉淀DNA并以10 uL溶解，纯化后的DNA于-80℃保存。以上均可用基因组DNA提取试剂盒按照说明书操作。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中Mh核苷酸序列（AF540381），利用Oligo6.71软件设计了4条特异性引物，并由上海生物工程有限公司合成，均稀释到10 pmol·μL-1，其引物如表1：

表1 猪肺炎支原体LAMP引物Table 1 Swinemycoplasma hyopneumoniae LAMP primer

1.4 LAMP扩增最佳反应体系（表2）

反应体系配制好后瞬时离心，放入水浴锅60℃下反应60min、85℃反应5min即可。具体操作参照李鹏等[5]的方法进行。

表2 LAMP扩增反应体系Table 2 LAMP amplification reaction system

1.5 LAMP重复性试验

全部的待检样本均重检一次。

2 结果

2.1 病料的M h检测

实验应用LAMP技术共检测了64份患呼吸道病的猪肺脏病料，其中54份为阳性，占84.2%，表3为LAMP对各病料的检测结果。

表3 LAMP检测肺炎支原体阳性结果Table 3 Mycoplasma hyopneumoniae positive results detected by LAMP

2.2 健康猪鼻拭子的检测

共检测健康猪鼻拭子共176份，支原体阳性数为157份，阳性率为89.2%。

表4 LAM P对健康猪鼻拭子的检测结果Table 4 LAMP test results of nasal swabs of healthy pigs

2.3 重复性试验

全部材料重复检测一次，结果一致。

3 讨论

猪气喘病又称为猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae of swine，MPS），此病是长期以来在猪场中难以净化的一种疾病。尤其近年来研究发现，猪肺炎支原体可与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），圆环病毒2型（PCV2）以及其他病原体混合感染，使感染的严重程度进一步提高，造成养猪业的重大经济损失[6]。因此，及时准确地检测猪群中猪肺炎支原体的感染情况变得尤为重要。日前，用于检测猪肺炎支原体的方法主要包括分离培养法、免疫荧光法、核酸探针法和PCR法等[7]。传统分离培养法费时，操作复杂，对技术要求高，除非在条件具备的实验室作特殊的诊断外，一般不将分离培养作为病原诊断方法；免疫荧光法适用于急性感染期检测，此时患病猪肺内存在大量的病原。但患病猪在受到抗生素治疗后或转为慢性感染时，血清阳性猪支原体数量不足以用免疫荧光技术检出而易出现假阴性；核酸探针法虽然简单、灵敏，但各种类型支原体之间常有交叉反应，易出现假阳性，影响检验准确性。PCR和实时荧光定量PCR方法虽然可以克服支原体培养难、易产生交叉反应的缺点，还具有敏感性高、特异性强的特点。然其敏感性非常好且能有效避免污染，但由于需要昂贵的试验器材及试剂，且对实验室环境要求高以及在检测时易出现假阳性等缺点而难以推广到临床应用[8]。研究根据GenBank上发表的猪肺炎支原体的核苷酸序列，针对该核苷酸序列设计4条特异性引物，其外引物扩增片段大小为276 bp，通过对内外引物的比例、dNTP+浓度、Mg2+浓度和Bst DNA聚合酶用量等条件逐一优化后，成功建立的猪支原体环介导等温扩增方法（LAMP）。LAMP方法在恒温60℃条件下1 h特异性较强，其敏感性为当其猪肺炎支原体的拷贝数低于为3～6时，不能检测到该病原体。且经特异性试验中检测多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌均呈阴性。与常规PCR反应相比，LAMP法大大缩短了检测时间，且能够特异性鉴别猪肺炎支原体，其敏感性与常规PCR方法一致，但该方法具有较好的临床应用性。

应用LAMP技术诊断结果表明：对来自黑龙江不同地区的患猪呼吸道疾病的肺脏病料64份进行检测，54份诊断为阳性，阳性率84.3%。健康猪鼻拭子共176份，经LAMP检测，157份阳性，阳性率为89.20%。健康猪鼻拭子带菌率较高，这一检测结果与郭盼盼等的报道基本一致，应引起兽医工作者高度重视。

［1］Fablet C，Marois C，Kobisch M，et al.Estimation of the sensitivity of four sampling methods for Mycoplasma hyopneumoniae detection in live pigs using a Bayesian approach［J］.VetMicrobiol，2010，143（2）：238-245.

［2］Marois C，Dory D，Fablet C，et al.Development of a quantitative Real-Time TaqMan PCR assay for determination of the minimal dose of Mycoplasma hyopneumoniae strain 116 required to induce pneumonia in SPF pigs［J］.JAppl Microbiol，2010，108（5）：1523-1533.

［3］Caron J，Ouardani M，Dea S.Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes［J］.JClin Microbiol，2000，38（4）：1390-1396.

［4］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated i-sothermal amplification of DNA［J］.Nucleic acids research，2000，28（12）：63-67.

［5］李鹏，马艳娇，于剑，等.猪肺炎支原体环介导等温扩增检测方法的建立［J］.中国生物制品学杂志，2011，24（4）：480-483.

［6］赵东升，刘有昌，李祥健，等.猪肺炎支原体与其他病原的相互作用［J］.养猪，2008（5）：66-68.

［7］侯美如，侯喜林，高俊峰，等.牛轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2011（3）：19-23.

［8］郭盼盼，黄书林，张跃伟，等.环介导等温扩增技术快速诊断猪肺炎支原体［J］.农业生物技术学报，2010，18（4）：822-826.