超声波法提取沙棘叶总黄酮最佳工艺的研究

孙天宇，杨宏志

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319）

沙棘（Hippophae rham noides Linn.）为胡颓子科植物，落叶灌木，它属一种雌雄异株的落叶性灌木或小乔木。耐寒冷，耐干旱适应性强，中国是沙棘资源最丰富的国家，占世界沙棘总面积的95%，在这种情况下，合理开发沙棘资源，提高沙棘资源的附加值具有重要的意义[1]。

黄酮类化合物（navonoids），它主要存在于沙棘的所有部位—根、茎、叶、花和果实中。黄酮是人体必需营养素，因其具有抗癌、抗氧化的作用且直接来源于天然的植物，专家预测沙棘黄酮类的系列保健产品很快会风靡全世界[2]。

响应面分析法是一种通过分析回归方程、拟合因素和响应值之间的函数关系的一种统计方法，与其他分析方法比较，它具有精度高，试验次数少，可充分体现多种因素交互作用的特点。因此，响应面分析法已经被广泛应用于生产和科研等领域[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

沙棘叶是由黑龙江省农科院植保所提供的；芦丁标准品（成都思科华生物技术有限公司）；石油醚、乙醇、氢氧化钠等（北京化工厂）试剂均为分析纯。

1.2 仪器

AR2140型分析天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；TGL-16G飞鸽离心机（上海安亭科学仪器厂）；R-201型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），索氏提取器，电热鼓风干燥箱，C型超声波药品处理机（济宁金百特电子有限公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 原料的预处理

新鲜的沙棘叶干燥粉粹后过80目筛子，用石油醚在索氏提取器中脱脂，除去脂肪及油溶性杂质。

1.3.2 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

准确称取经105℃干燥至恒重的芦丁标准品0.027 1 g，加适量甲醇溶解移至容量瓶并定容至100 mL，摇匀备用。从中再吸取5 mL，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，从中准确吸取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0与6.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，加水约6 mL，加5%三氯化铝甲醇溶液1 mL，加甲醇定容至刻度，摇匀，放置10 min，用紫外分光光度计在433 nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度C为横坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归[4]。得回归方程:

此方程的相关系数r=0.999 6。

总黄酮得率（mg·g-1）=提取的黄酮质量/沙棘叶中黄酮的总质量。

1.3.3 样品中总黄酮的提取及测定

准确称取1.000 0 g经干燥粉碎并脱脂后的沙棘叶样品放入具塞三角瓶中，加入一定体积分数的乙醇溶液，按照相应的条件在超声中进行提取，抽滤，浓缩后用甲醇定容于100 mL容量瓶中待用，吸取样品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，以没有加样品的溶液作为空白，按上述方法测定黄酮质量分数，带入回归方程，求得样液中总黄酮的量[5]。最终计算出黄酮的得率。

1.4 黄酮的提取

采用有机溶剂浸提法提取沙棘叶中的总黄酮，其提取率受有机溶剂种类及体积分数、提取温度、提取时间、液固比等因素影响，分别进行单因素试验[6]。准确称取一定量脱脂后的沙棘叶，分别在不同条件下提取，提取液抽滤后用旋转蒸发仪蒸干，统一定容后按1.3中的方法进行测定。

1.5 提取条件优化

在最佳单因素试验条件的基础上用SAS9.2软件设计响应面试验，对结果进行响应面回归和方差分析，对提取条件进行优化。得出最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

通过前期的准备实验可知黄酮类化合物是溶于甲醇、乙醇等有机溶剂的，因为乙醇具有无毒、渗透性强、浸出率高且对酶有抑制作用等特点，所以用乙醇作为提取沙棘叶中总黄酮的有机溶剂时效果最好，最终选用乙醇作为提取的有机溶剂[7]，分别采用体积分数为45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇为提取溶剂，结果如图所示：

图1 乙醇浓度对黄酮得率的影响Fig.1 The effect of ethanol thickness on tatle flavanone

从图1可以看出，总黄酮的提取率随着乙醇体积分数的增加先升高后又降低，用SAS9.2分析得出P＜0.000 1，影响极显著，乙醇浓度为75%的时候总黄酮的提取率最高，乙醇浓度的升高会使样品中的一些其他脂溶性物质相继溶解出来，从而影响了黄酮类物质的浸出。

2.1.2 温度对总黄酮提取率的影响

准确称取1.000 8 g经干燥粉碎脱脂后的沙棘叶样品，与体积分数为75%的乙醇溶液混合，在料液比为1∶25，超声功率为400 W的条件下，分别为35、45、55、65、75和85℃时，提取30 min[8]，每次重复做2个平行实验，结果如图所示：

图2 提取温度对黄酮得率的影响Fig.2 The effect of extraction temperature on tatle flavanone

由图2可见，在其他条件相同的情况下，经测定黄酮的提取率随提取温度的升高而增加，当温度达到55℃时黄酮得率最高，以后不再增加甚至开始下降，这是由于当温度升高时样品中的黄酮类化合物会发生氧化，经SAS9.2方差分析得P=0.064，影响不显著，但是考虑提取条件的经济实用性，所以最适提取温度确定为55℃。

2.1.3 超声时间对总黄酮提取率的影响

准确称取1.000 3 g经干燥粉碎脱脂后的沙棘叶样品，加入75%的乙醇并以1∶25的料液比混匀，在55℃的温度，超声功率为400 W的条件下，考察分别提取10、20、30、40、50和60 min的时候，总黄酮的提取率，每次重复做2个平行实验，结果如图3所示。

图3 提取时间对黄酮得率的影响Fig.3 The effect of extract time on tatle flavanone

由图3可见，超声时间在10～60 min之间，黄酮得率随着超声时间的延长而提高，在超声时间为30 min时黄酮得率达到最高，30 min之后效果开始下降，其原因可能是在长时间的超声作用下黄酮母核被破坏，导致黄酮得率降低[9]。经SAS9.2进行单因素方差分析，得P=0.001，即在α=0.01水平上超声时间对沙棘叶中总黄酮的得率影响显著，所以选择30 min作为最佳超声时间。

2.1.4 超声功率对总黄酮提取率的影响

超声波是高速震荡，增加组织内部能量使细胞快速破裂从而让细胞中物质迅速释放和扩散，且不改变天然物质的性质，选择超声功率在200、300、400、500、600和700 W时，考察黄酮类化合物的提取率，结果如图所示：

图4 超声功率对黄酮得率的影响Fig.4 The effect of ultrasonic on tatle flavanone

由图4可见，超声功率在200～700 W总黄酮得率在500 W时达到最高，之后随着功率的增加黄酮提取率无变化甚至稍有下降，经SAS9.2进行单因素方差分析，得P=0.001，即在α=0.01水平上超声功率对沙棘叶中总黄酮的得率影响显著，因此选择500 W作为最佳超声条件。分析原因可能是随着超声波功率的提高，热效应、空化效应和机械作用随之加强，更有利于细胞中物质的释放和扩散，当功率达到500 W时达到黄酮含量最大值，不再随着功率增加而增大。

2.1.5 料液比对总黄酮提取率的影响

准确称取1.000 2 g经处理后的沙棘叶样品与75%的乙醇溶液混合，在温度为55℃，超声功率500 W，超声处理30 min，并以1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45和1∶55的各条件下得出总黄酮的提取率，每次重复做2个平行实验，结果如图所示：

图5 料液比对黄酮得率的影响Fig.5 The effect of different liquor thickness on tatle flavanone

由图5可见，提取时的料液比在1∶5～1∶55的试验范围之内随着料液比的增加，黄酮得率增大，在1∶35得率最高，在实际操作中，用SAS9.2对结果进行单因素方差分析，P＜0.000 1即在α=0.01水平上，料液比对总黄酮的提取率影响极显著，因此选择料液比为1∶35作为最佳提取条件。

2.2 提取条件的优化

2.2.1 响应面法优化超声波提取沙棘叶中总黄酮的工艺

在单因素的基础上，用SAS9.2软件进行响应面试验设计，选择4因素3水平的Box-Behnken设计，测定不同提取时间、乙醇体积分数、液固比、超声功率条件下的沙棘叶中总黄酮的得率[10]。因素与水平设计及见表1。

2.2.2 结果与分析

为考察各因素对黄酮得率的影响，根据表3中实验结果，以黄酮得率为指标，利用SAS 9.2数据处理系统对实验结果进行多元回归分析，结果见表4。

表1 因素水平编码表Table 1 Factors and their coded levels in central composite table

表2 二次回归旋转组合设计及实验结果Table 2 Quadratic regression orthogonal rotation combination design and test results

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the established regression model

表3说明二次回归模型的F值为25.02，大于F(14，12)0.01=4.05，且P值＜0.000 1，而失拟性的F值为38.10，小于F(10，2)0.01=99.39，说明该模型的拟和结果好。决定系数R2=0.966 9一次项，二次项F值均大于0.01水平上的F值，说明各个因素对黄酮得率有极其显著的影响，而交互项大于0.01水平上的F值，说明各个因素之间的交互作用对黄酮得率有显著影响。

表4 回归方程系数t检验方差分析Table 4 T-test analysis of variance of each coefficient in the established regression model

由表4检验方差分析得，各因素对沙棘总黄酮得率的影响程度从大到小的顺序依次为：乙醇的体积分数（X1），超声功率（X3），料液比（X4），提取时间（X2）。

通过SAS9.2数据统计分析软件进行回归分析，得二次回归方程为：

Y1=-268.164 167+4.485 333X1+1.237 000X2+ 0.101 183X3+3.394 000X4-0.023 767X12+0.007 200X1X2-0.000 480X1X3-0.023 000X1X4-0.024 967X22-0.000 565X2X3+0.001 900X2X4-0.000 024 292X32-0.000 560X3X4-0.019 417X42

通过超声波法提取沙棘叶总黄酮的四因素三水平的设计优化工艺，SAS9.2统计分析软件分析，试验结果见表5：

表5 响应面法优化结果的验证实验结果Table 5 The results of verification test of response surface methods

由表5可知，以沙棘叶总黄酮的得率为响应值，由中心组合设计结果分析后，根据实际条件，可确定的达到总黄酮得率最大值的最优组合为：乙醇浓度76.04%，超声时间30.7 min，超声功率561.5 W，料液比1∶36。得出提取黄酮得率为10.49 mg·mL-1。在响应面法所预测的理论最佳提取条件下做三次验证实验，得出提取黄酮得率平均值为10.51 mg·mL-1。实测的均值与理论值误差小于5%，说明回归方程拟合性良好。

3 结论

目前，沙棘叶总黄酮的提取方法主要有水提法、有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和超临界流体萃取法。超声波辅助提取法提取效率高，提取时间短[11]。本研究以乙醇溶液为提取剂提取沙棘叶总黄酮，并用响应面设计法进行优化，最佳提取条件为:超声功率为561.5 W，乙醇体积分数为76.04%，超声时间为30.7 min，料液比为1∶36，黄酮得率为10.51 mg·mL-1。同其他方法比较，此方法设备简单，成本低，见效快，适于工业化生产。经响应面设计法优化后，可以找到各因素的最佳值并获得较理想的得率;同时，各个因素间的相互作用对生产过程中工艺参数的设置提供了参考[12]。对实际生产更有指导意义，在生产和科研中必将有着广阔的应用前景。

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