米糠蛋白抗氧化肽的制备及初步分离

李喆，翟爱华

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319）

米糠是大米加工的主要副产品，蛋白质含量为12%～16%（大米中为7%左右），比普通精米高出1倍以上，因此联合国工业发展组织把米糠称为一种未被充分利用的原料[1]。我国米糠资源丰富，年产米糠1 000万t以上，约占世界1/3[2]，但米糠大多作为饲料被简单的利用，只有很小一部分被用做米糠油和天然活性成分的提取，利用效率不足20%[3]，造成了严重的资源浪费，尤其是米糠中蛋白质的浪费,与国外相比我国的米糠精深加工比较滞后。

国外对稻米及副产品高效增值深加工已实现产业化，对于米糠的研究开发非常广泛和深入。据不完全统计，国内外迄今有关米糠深加工的专利有50多项，以米糠为原料开发的产品更是有上百种之多，产品主要集中在食品、日化和医药三大行业中[4]。

自从英国学者Haman提出自由基理论以来，人们开始认识到体内氧化产生的自由基与人体衰老和许多疾病都有关[5]。抗氧化剂由于能清除机体自由基而具有抗衰老、预防癌症等的作用，因此可作为功能因子用于食品、药品及保健品的开发。抗氧化肽作为一种非酶类自由基清除剂的研究正在兴起[6]，如大豆蛋白抗氧化肽、玉米蛋白抗氧化肽、小麦蛋白抗氧化肽等。国内外对米糠蛋白抗氧化肽的研究报道较少，付岩松所在实验室利用AS1.398中性蛋白酶酶解米糠蛋白制得抗氧化肽对邻苯三酚自氧化抑制达44.44%[7]。研究以米糠蛋白为原料，采用酶法提取功能性抗氧化活性肽，并研究了其初步分离工艺，旨在为米糠的精深加工及综合利用提供理论基础和实践依据。试验采用碱性蛋白酶酶解米糠蛋白，以期获得具有高抗氧化活性的肽，并采用超滤和Sephadex G-25柱层析初步分离纯化米糠蛋白抗氧化肽。

1 材料与方法

1.1 材料

米糠蛋白：北大荒希杰食品科技公司。

Sephades G-25：安玛西亚生物技术（上海）有限公司。

碱性蛋白酶（Alcalase）：购于诺维信（中国）生物技术有限公司。

DPPH购于美国sigma公司，氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠及其他试剂均为分析纯购于天津市大茂化学试剂厂生产。

1.2 主要仪器

紫外可见分光光度计，T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司；电子天平，AR2140梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；低速离心机，LD5-10B，北京京立离心机有限公司；台式离心机，上海安亭科学仪器厂；pH计，PH-3C，上海安亭雷磁有限公司；电热恒温水浴锅，DK-S24，上海森信试验仪器有限公司；试验用膜分离装置中空纤维膜组件，NF-UF-4010，上海摩速科学器材有限公司；程控全自动部分收集器，CBS-100A，上海青浦沪西仪器厂；恒流泵，HL-2S，上海青浦沪西仪器厂；电脑紫外检测仪，HD-9707，上海精科实业有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米糠蛋白抗氧化肽的制备

米糠蛋白按一定底物浓度加水配成悬浮液，90℃加热预处理10 min降温至所需温度后加1 mol·L-1氢氧化钠溶液调pH，恒温恒pH下搅拌15 min待pH稳定后加入酶水解（水解过程中不断加入氢氧化钠溶液维持pH在规定范围的±0.05内），反应结束后迅速加热10min灭酶，离心（4 000 r·min-1，15min），收集上清液备用。

1.3.2 清除DPPH自由基活性测定

DPPH自由基在有机溶剂中呈紫色且非常稳定，在517 nm附近有特征吸收，当有自由基清除剂存在时，在517 nm处的特征吸收吸收减弱或消失，则说明被测物具有抗氧化活性[8]。

取2mL待测样品于EP管中，再加入2 mL浓度为0.01mmol·L-1的DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，反应20min，4 000 r·min-1下离心10 min，取上清液在波长517 nm处，测其吸光度A1；另取2mL待测样品于EP管中，加入无水乙醇2 mL，反应20 min，4 000 r·min-1下离心10min，取上清液在波长517 nm处测其吸光度A2；以2 mL浓度为0.01 mmol·L-1的DPPH无水乙醇和2 mL无水乙醇反应做为参照，其吸光度记为A0[9]。按照下式计算待测样品对DPPH自由基的清除率：

式中，K——对DPPH自由基的清除率，%；

A0——2 mL浓度为mmol·L-1的DPPH无水乙醇溶液加2 mL无水乙醇时的吸光度；

A1——2 mL浓度为mmol·L-1的DPPH无水乙醇溶液加2mL待测样品的吸光度；

A2——2 mL无水乙醇加2 mL待测样品的吸光度。

1.3.3 正交试验

在预试验基础上，选择5种因素（温度、时间、底物浓度、pH、加酶量）进行正交试验，选择正交表L18（37）进行试验设计。

正交试验的因素与水平设计见表1。

表1 正交试验的因素与水平设计Table1 Factor and level design of orthogonal experiment

1.3.4 超滤分离

米糠蛋白酶解液分别选用截留分子量为10 KDa和5 KDa的中空纤维膜对其进行超滤，经过预试验确定超滤条件为压力0.1 MPa，温度40℃，物料浓度3%，pH为8.0；分别收集不同分子量肽段的分级产物，测定每一组分的DPPH自由基清除率。

1.3.5 Sephades G-25凝胶过滤层析

将处理好的Sephades G-25用蒸馏水平衡后装柱（1.0 cm×100 cm），米糠肽溶液先过0.22μm的微滤膜。柱层析条件为：上样量为1.0 mL，流速为0.5 mL·min-1，样品浓度为100 mg·mL-1，洗脱液为蒸馏水，在波长220 nm处检测，分管收集，每管2mL，分别测定各峰的抗氧化活性。

2 结果与分析

2.1 正交试验分析

以DPPH自由基清除率为评价指标，进行正交试验设计。

正交试验结果与分析见表2。

表2 正交试验结果与分析Table2 Orthogonal test results and analysis

从表2可以看出，各因素的极差R明显不同，A因素的R值最大，其次为C因素。E因素的R值最小，因此各因素对酶解产物抗氧化活性的影响从大到小的顺序依次为：A（温度）>C（时间）>B（pH）>D（底物浓度）>E（加酶量）。正交试验表明，各因素最优组合为：A2B3C2D2E3。最佳的酶解条件是：酶解温度45℃，pH 9.0，时间60min，底物浓度3%，加酶量3 000 U·g-1。采用最优试验参数制备米糠蛋白酶解物，并对其进行分离纯化。

2.2 超滤分离

超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制滤膜，而大分子物质不能透过，留在膜的一边，使其得到分离[6]。采用超滤膜设备将米糠蛋白酶解产物分成Mr≥10 KDa，5 KDa≤Mr≤10 KDa，Mr≤5 KDa三个组分。分别测定其DPPH自由基清除率，如图1所示。

由图1可知，Mr≥10 KDa，5 KDa≤Mr≤10 KDa和Mr≤5 KDa三种米糠蛋白酶解组分对DPPH自由基都具有一定的清除能力。但是组分C即分子量≤5 KD的肽混合物的清除能力明显高于其他两种组分。

2.3 Sephades G-25凝胶层析

将超滤分离得到的组分C再经Sephades G-25柱层析进一步分离纯化。Sephades G-25分离米糠蛋白抗氧化肽的洗脱曲线见图2，Sephades G-25纯化所得组分对DPPH自由基的清除率见表3。

从图2可以看出，有4个混合组分被发现。抗氧化试验结果表明，各组分抗氧化活性由大到小顺序依次为：混合组分Ⅱ>混合组分Ⅰ>混合组分Ⅳ>混合组分Ⅲ，且这4个混合组分的DPPH自由基清除率均为63%以上。

表3 SephadesG-25纯化所得组分对DPPH自由基的清除率Table3 Clearance rate of Sephades G-25 purification components on DPPH free radicals

3 结论

通过正交试验，得到米糠蛋白抗氧化肽的最优工艺条件为：酶解温度45℃，pH 9.0，时间60min，底物浓度3%，加酶量3 000 U·g-1。在米糠蛋白酶解产物中，Mr≤5 KDa组分的抗氧化活性最强，其对DPPH自由基清除率为68.7%。通过Sephades G-25凝胶层析柱进一步分离得到4个组分，它们的抗氧化活性由大到小的顺序依次为：组分Ⅱ>组分Ⅰ>组分Ⅳ>组分Ⅲ。

[1]陈正行，姚惠源，周素梅.米蛋白和米糠蛋白开发利用[J].粮食与油脂，2002（4）:6-9.

[2]姚惠源，周素梅，王立.米糠与米糠蛋白质的开发利用[J].无锡轻工业大学学报，2002，21（3）:312-316.

[3]陈正行.米糠:一种潜在的健康食品优质原料[J].粮食与饲料工业，1999，27（10）:20-25.

[4]吕莹果，张晖，王立，等.米糠资源的综合利用[J].粮食与饲料工业，2009，37（4）:19-22.

[5]Haman D Aging.A theory based on free radical and radiation chemistry[J].JGerontol，1956，11:298-300.

[6]王亚林，刘国志.蛋白活性肽的制备工艺研究[J].粮食与饲料工业，2003（6）:46.

[7]付岩松.米糠抗氧化肽对D-半乳糖致衰小鼠线粒体损伤的影响[D].沈阳:沈阳农业大学，2010.

[8]郑建仙.功能性食品：第二卷[M].北京:中国轻工业出版社,1995.

[9]张君慧.大米蛋白抗氧化肽的制备分离纯化和结构鉴定[D].无锡:江南大学，2009.