未成熟卵体外成熟技术在卵巢高反应患者IVF-ET中的应用

黄 绘 洪 焱 冯玉蓉 刘敏利 胡皓睿 潘世春

贵州省贵阳市妇幼保健院生殖中心(550003)

随着辅助生殖技术的发展，人类未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)技术成为治疗不孕症的新途径，对于进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的多囊卵巢(PCO)、多囊卵巢综合征(PCOS)和卵巢对促性腺激素(Gn)高反应患者，行常规IVF-ET控制性卵巢刺激(COS)效果不佳，难以控制Gn用量，更存在卵巢过度刺激综合征(OHSS)的危险［1］。IVM技术为有OHSS风险的患者提供了新的治疗途径。Lin等［2］报道，有OHSS风险的患者行IVM联合体外受精技术治疗，获得了47.1%(8/17)的妊娠率。本研究对IVM技术应用于促排卵药物高反应者IVFET情况进行临床总结，探讨其应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2009年3月～2010年12月在本中心进行IVF治疗的不孕夫妇28对，30个周期，女方年龄30.28±3.5岁，不孕时间5.33±2.09年。不育原因包括输卵管因素19例(其中15例合并PCO)，PCOS 6例，双方因素(输卵管因素和畸精子症)4例，男方因素1例。

1.2 促排卵方案

30个周期均常规使用促性腺激素释放激素激动剂/卵泡刺激素(GnRHa/FSH)长方案促超排卵［3］，黄体期降调节，在降调14d，月经来潮5d后开始使用Gn促排卵，Gn刺激4～7d，B超监测发现双侧卵巢卵泡数目≥20个，最大卵泡直径≤12mm时，征得患者同意行全部小卵泡穿刺取卵或部分小卵泡穿刺取卵术。A组12例全部行小卵泡穿刺，其中1例为出现优势卵泡后穿刺全部小卵泡。B组18例，其中15例在最大卵泡直径≤12mm时即穿刺部分卵泡，另3例在多个卵泡直径＞14mm时才穿刺部分卵泡，保留9个以下卵泡继续按照常规IVF-ET促排治疗，直至卵泡成熟取卵，以减少获卵数，避免重度OHSS的发生。

1.3 未成熟卵的采集

超声引导下经阴道取卵，使用17-gauge单腔取卵针，吸引压力为7.5kPa。将得到的卵泡液在解剖显微镜下经仔细辨认，挑选出卵-冠-丘复合体移入IVM培养液，放入37℃ 5%CO2培养箱培养，26～28h后置显微镜下确认第一极体是否释放。

1.4 IVF

获得的未成熟卵经体外培养26～28h后，将所有卵母细胞脱去颗粒细胞，在倒置显微镜下观察，选择有第一极体的成熟卵母细胞，采用卵胞浆内单精子注射(ICSI)进行受精［4］。其余未成熟的卵母细胞继续培养24h及48h，分别观察2次，如有成熟卵母细胞即予同样方法受精。

1.5 ET

ICSI后16～20h观察卵母细胞受精情况，36h后观察胚胎发育情况。选择卵裂球数多、均匀透亮、碎片少的胚胎在72h移植回宫腔。多余良好胚胎进行冷冻保存，择期进行冻融胚胎移植。每周期移植胚胎数平均为2.24个。

1.6 子宫内膜准备

A组所有病例均在小卵泡穿刺术后常规给予补佳乐每日4～6mg，ET前3天注射黄体酮80mg/d。内膜厚度7mm以上进行ET，否则行胚胎冷冻。

1.7 妊娠测定

移植后2周尿妊娠试验阳性者于第7周行B超检查，见原始血管搏动者为临床妊娠。

1.8 数据统计

采用SPSS11.5软件包进行统计学分析。两组患者一般情况比较采用两个独立样本间的t检验;两组患者治疗结果之间率的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法检验。

2 结果

2.1 一般情况

两组年龄、不孕时间及基础内分泌值比较差异无统计学意义(P＞0.05)，Gn用量差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。

2.2 IVM 治疗

28对夫妇共进行了30个周期的治疗，共获未成熟卵240个，平均每周期8.28个。进行体外培养后147个卵成熟(61.25%)，其中26～28h成熟78个，50～52h成熟50个，74～76h成熟19个。A组进行了8个周期IVM新鲜胚胎移植，ET日子宫内膜厚度7～11mm，4例临床妊娠。A组3例和B组5例进行了IVM冻融胚胎移植周期治疗，3例临床妊娠(A组1例，B组2例)，已有3例共分娩了5个健康婴儿。

A组中有1例为出现优势卵泡后提前穿刺所有小卵泡，获11个未成熟卵，经IVM受精后获2个优质胚胎，ET未孕。B组中有3例出现多个直径＞14mm卵泡，因卵泡过多而穿刺部分卵泡，获卵数少，分别为2、3、4个，其中2例培养后无成熟卵，1例胚胎质量差，均无可移植胚胎。B组18例中13例进行了IVF-ET，5例临床妊娠，获IVM冷冻胚胎22个，包括11个周期因无IVF冷冻胚胎而行IVM冻融胚胎移植5个周期，2例临床妊娠。A组12例无OHSS发生，B组18例中3例有发生0HSS风险(双卵巢平均直径＞60mm，盆腔中等量积液)而取消胚胎移植。IVM及IVF治疗结果无统计学差异(P ＞0.05)，见表2。

表1 两组对象一般情况比较±s)

表1 两组对象一般情况比较±s)

*与B组比较P＜0.05

组别 周期数(个)E T 周期用量(支，0.1mg/支)GnRHa Gn A 组 12 30.92 ±2.68 5.00 ±2.45 7.76 ±2.77 7.22 ±4.23 153.22 ±70.92 1.80 ±0.84 11.54 ±4.29 10.33 ±4.52年龄(岁)不孕时间(年)FSH(U/L)LH(U/L)(pmol/L)(nmol/L)*.25 B 组 18 29.82 ±4.00 5.61 ±1.85 6.95 ±1.30 5.47 ±2.60 164.50 ±105.39 1.99 ±0.70 12.00 ±2.20 19.89 ±8

表2 两组对象IVM及IVF治疗结果

3 讨论

IVM技术的开展为IVF-ET技术临床运用提供了有效的补救方法，可以减少取消IVF-ET治疗周期的发生。目前多数IVF中心对于部分合并有PCO及PCOS不孕患者的治疗仍采用常规COS促排方案，进行常规IVF-ET。这部分患者或对促排卵药物反应性低，卵泡不生长，导致取消治疗周期，或卵巢对药物敏感性强，稍增加Gn用量即出现大量卵泡发育，不可避免地发生OHSS，也有可能放弃治疗周期。IVM技术开展以后，这些患者的治疗有了另一种选择。在患者IVF治疗过程中，当出现卵泡数过多，一般双卵巢卵泡数＞20个，可能发生较重的OHSS时，可在患者知情同意下进行小卵泡穿刺术，改行IVM治疗。本文30个周期，除IVF-ET 13个周期外，IVM移植16个周期，包括8例新鲜胚胎移植周期和8例冻融胚胎移植周期，临床妊娠率43.75%(7/16)，同时有17个周期获得45个 IVM冷冻胚胎。由此可见IVM技术能获得与常规IVF相当的临床妊娠率(20% ～35%)［3～5］。是 IVF -ET有效的补充方法。其还可以补救未成熟卵，提高卵的利用率，如B组提前穿刺部分小卵泡行IVM，获得的优质胚胎予以冷冻，增加了每个取卵周期患者的妊娠机会。A组全部小卵泡取卵可完全避免0HSS发生，减少Gn用量，缩短治疗周期，消除长期大剂量应用Gn给患者带来的副反应，降低费用，并获得较好的临床妊娠率。本研究为COS中使用Gn-RHa后，再行Gn促排，能控制内源性LH峰出现，防止卵泡过早黄素化，提高卵母细胞质量、优质胚胎率和着床率，可能与较好的临床妊娠率有关，但由于研究例数尚少，有待于扩大样本量进一步研究。

取卵时机尤为重要，应在卵泡直径≤12mm时取卵，卵泡直径过大应放弃IVM治疗。本文B组3例卵泡过大取卵均获卵数少，无可用胚胎。A组取卵时机均控制在卵泡直径＜12mm，12例中11例均有1个以上优质胚胎，8个周期进行了IVM新鲜周期胚胎移植，4例临床妊娠;另有6个周期获得23个IVM冷冻胚胎。

子宫内膜的准备也是IVM成功的关键因素，本文通过及时补充黄体酮使子宫内膜达到一定厚度才行胚胎移植，取得较好效果。

IVM技术对于COS卵巢过度反应者不失为一种有效的补救治疗方案。目前IVM虽然已获得较为理想的妊娠率，但其安全性还没有得到充分证实［6］，IVM仍有许多问题有待解决，而随着卵子成熟机制及各种重要影响因素的逐步阐明和培养系统的优化，IVM的成功率有望更高，应用范围也会更广。

1 Cobo AC，Requena A，Neuspiller F，etal.Maturation in vitro of human oocytes from unstimulatedcycles:selection of the optimal day for ovum retrieval based on follicular size［J］.Hum Reprod，1999，14(7):1864-1868.

2 Lin J，Lu G，Qian Y，etal.Pregnancies and births achieved from in vitromatured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in vitro fertilization cycles［J］.Fertil Steril，2003，80(2):447-449.

3 邓晓惠.生殖医学技术及其彩色图谱［M］.济南:山东科学技术出版社，2004:25.

4 滕晓明，程怀瑾.卵胞质内单精子注射在治疗不孕症中的应用［J］.中华男科学杂志，2005，11(7):379- 380.

5 刘嘉茵，钱云，冒韵东，等.人未成熟卵母细胞体外培养成熟、受精及胚胎移植［J］.中华妇产科杂志，2003，38:30 -32.

6 Piquette GN.The in vitromaturation(IVM)of human oocytes for in vitro fertilization(IVF):is it time yet to switch to IVM-IVF?［J］.Fertil Steril，2006，85(4):833 -835.

［责任编辑:张 璐］