针刺对急性骨骼肌钝挫伤大鼠肌卫星细胞增殖的影响

李俊华，王正珍，王军力，唐云峰

挫伤和拉伤是运动医学临床上常见的骨骼肌损伤。挫伤后所引起的肌肉组织的血肿机化、瘢痕修复不仅影响运动员的运动能力，且对运动寿命构成了潜在威胁，是造成全球运动员困扰的难题之一［6］。

斜刺阿是穴治疗骨骼肌损伤，具有疗效高、见效快、疗程短、疗效持久稳定、费用低、操作简便等显著优点。它不仅适用于运动引起的骨骼肌损伤，也适用于体力劳动和日常生活所引起的骨骼肌损伤，并对各年龄段患者的急性和慢性损伤都有很高的疗效。阿是穴斜刺能够迅速加强肌肉收缩蛋白的组装合成，使收缩结构和功能恢复正常、疼痛消失，因而疗效持久、稳定。本研究采用针刺治疗骨骼肌损伤，用自然愈合作为对照，比较并观察骨骼肌钝挫伤后针刺对骨骼肌损伤修复过程中肌卫星细胞增殖的影响，探讨针刺对骨骼肌损伤修复的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

雄性SD大鼠，8周龄，体重220～250g，级别：SPF，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.1.2 主要实验仪器

1.苏州针灸用品有限公司生产的环球牌一次性无菌针灸针：0.25×40 mm，XSZ－H光学显微镜。

2.ERMAINC切片机；KD－BM生物组织包埋机；MIAS医学头像分析管理系统。

1.1.3 实验主要试剂

小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（PCNA），即用型SABC试剂盒，一抗稀释液，DAB显色试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验大鼠骨骼肌钝挫伤模型的建立

大鼠购进后适应性喂养2天，参照Kami等［18］的方法，制作本次实验的大鼠骨骼肌钝挫伤模型：即2％戊巴比妥钠，按0.25 ml/100 g［7］剂量进行腹腔注射，大鼠麻醉后俯卧位固定四肢，伸膝、踝背屈90°，用自制打击装置从15 cm高处自由垂直落下打击大鼠右小腿内侧面（其皮下为腓肠肌中段），打击面直径1.0 cm，下落物体长20 cm，重500 g，重力7.96 N，动能2.54 J。经解剖证实大鼠腓肠肌钝挫伤成功率100％。损伤程度相当于人体中度挫伤。

1.2.2 实验分组和治疗方案

将60只大鼠随机分为正常组6只，造模后随机分为即刻组6只、自然愈合组24只和针刺治疗组24只。自然愈合组（对照组）和针刺治疗组（实验组）又根据取材时间进一步分为损伤后第1天、第2天、第4天和第6天组。针刺治疗组在损伤局部进行针刺治疗，采用苏州针灸用品有限公司的环球牌一次性无菌针灸针0.25×40 mm，取阿是穴，以损伤为中心，距损伤15 mm处进针，斜刺。每天1次，留针，每次15 min，共针刺6天。自然愈合组不采用任何方法治疗，自然愈合。

大鼠阿是穴选取的依据：早在2000年前《灵枢经·经筋第十三》就有关于治疗肌肉损伤的记载要“以痛为腧”，就是现在的“阿是穴”；《灵枢经·官针第七》中记载的针法“浮刺”、“合谷刺”等都是斜刺。卢鼎厚在继承这一方法的20多年的实践中把“以痛为腧”发展为“以损伤的肌束为主、疼痛为辅”确定阿是穴［3］，斜刺针法不变。在找到人体阿是穴的理论依据的同时，查阅相关针灸动物实验和兽医针灸学文献发现，动物穴位的确定模拟人体穴位的居多，但穴位的比例比人体穴位的比例小。因此，本研究采用卢鼎厚的“以损伤的肌束为主、疼痛为辅”确定人体阿是穴的理论作为确定本次实验大鼠的阿是穴选取和定位的依据。

1.2.3 测试样本采集与制备

烧杯内倒入正己烷，并把烧杯悬吊于温度可达－73℃的干冰容器内，杯底与干冰液面接触，待装有正己烷的烧杯底呈现白霜时即可。每组从6只大鼠中随机取4只称重后，用2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，0.25 ml/100 g，腹主动脉取血后，速取右侧损伤处腓肠肌并将其切成小块，投入用干冰预冷的装有正已烷（－70℃）的小烧杯中速冻，之后取出用锡纸编号、包好，冰冻暂存。取材完成后把腓肠肌标本转移至－80℃冰箱保存，备用。

1.2.4 PCNA检测

采用常规三步免疫组化法，按试剂盒说明进行操作。以PBS代替一抗作阴性对照，结果在镜下细胞核内信号呈棕黄色颗粒者为PCNA阳性。每张切片选取5个肌卫星细胞阳性最多的视野。所有图像用MIAS医学头像分析管理系统进行组织切片的图像分析，测定腓肠肌卫星细胞的面密度，对其进行定量分析。

1.2.5 数理统计

使用统计学分析软件SPSS 13.0 for Windows对数据进行统计学处理，所有数据以平均值±标准差（±SD）表示。组间组内均采用单因素方差分析，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异。

2 研究结果

2.1 针刺治疗组大鼠骨骼肌损伤后不同天数肌卫星细胞增殖情况

在光镜下见正常组和损伤即刻组大鼠腓肠肌卫星细胞PCNA阳性核表达均为阴性。

伤后第1天，针刺治疗组大鼠腓肠肌中肌卫星细胞PCNA阳性核开始出现；伤后第2天，肌卫星细胞PCNA阳性核数目急剧增加达高峰，与第1天、第4天、第6天比较均有极显著性差异（P＜0.01），之后呈下降趋势；伤后第4天肌卫星细胞PCNA阳性核数目降至第2天的约1/2倍，但高于第1天和第6天，与之比较均有显著性差异（P＜0.05）；伤后第6天肌卫星细胞PCNA阳性核数目降至6天来最低水平，与第1天比较无显著性差异（表1）。

表1 本研究不同天数针刺治疗组与自然愈合组大鼠肌卫星细胞增值情况一览表 （±SD）

表1 本研究不同天数针刺治疗组与自然愈合组大鼠肌卫星细胞增值情况一览表 （±SD）

注：＊表示两组在伤后不同天数肌卫星细胞增殖的比较，＊＊P＜0.01，＊P＜0.05。

伤后第1天 伤后第2天 伤后第4天 伤后第6天针刺治疗组 0.007±0.0044 0.0344±0.014＊＊ 0.01735±0.0146＊0.0065±0.00283自然愈合组 0.0047±0.0036 0.00768±0.00355＊ 0.0115±0.0058＊＊0.0081±0.0066

2.2 自然愈合组大鼠骨骼肌损伤后不同天数肌卫星细胞增殖情况

伤后第1天，自然愈合组大鼠腓肠肌中肌卫星细胞PCNA阳性核也开始出现；伤后第2天，大鼠腓肠肌中肌卫星细胞PCNA阳性核继续增加，与第1天比较有显著性差异（P＜0.05）；在损伤后第4天达高峰，与第1天比较有极显著性差异（P＜0.01），与第2天比较有显著性差异（P＜0.05），之后呈缓慢下降趋势；伤后第6天，肌卫星细胞PCNA阳性核略高于第2天水平，与之比较无显著性差异，但与第1天、第4天比较均有显著性差异（P＜0.05；表1）。

2.3 不同天数针刺治疗组与自然愈合组大鼠骨骼肌损伤后肌卫星细胞增殖比较

与自然愈合组比较，针刺治疗组大鼠腓肠肌中肌卫星细胞PCNA阳性核数呈急升快降趋势，而自然愈合组则呈缓升缓降趋势，同时，肌卫星细胞PCNA阳性核数达高峰的时间明显早于自然愈合组。在数量上，伤后第1天、第4天针刺治疗组肌卫星细胞PCNA阳性核数略高于自然愈合组，伤后第6天略低于自然愈合组，但两组比较均无显著性差异（P＞0.05），在伤后第2天，却明显高于自然愈合组，2组比较有极显著性差异（P＜0.01，表1；图1）。

图1 不同天数针刺治疗组与自然愈合组肌卫星细胞增殖情况比较示意图

3 分析与讨论

3.1 大鼠损伤后骨骼肌卫星细胞增殖活性变化情况

在整个骨骼肌再生的过程中，决定整个肌肉再生最重要的2个阶段是巨噬细胞吞噬坏死组织和卫星细胞被激活。但就肌肉再生这一过程，主要是由卫星细胞来完成的。骨骼肌损伤后肌纤维的再生来源主要是肌卫星细胞的分化。

从分子生物学的角度看，肌卫星细胞的激活以及增殖分裂，最后形成成熟的肌纤维是一个非常复杂的过程。肌卫星细胞的活化一般出现在巨噬细胞开始吞噬坏死的纤维后，说明卫星细胞的激活与巨噬细胞分泌的某些物质有关，此外，肌卫星细胞的激活还受其他因素的调节。

肌肉损伤后引起肌纤维坏死，使趋向死亡的组织部位的卫星细胞出现增殖、愈合、形成新的肌纤维，取代以前的坏死纤维。在肌纤维修复过程中，坏死部位、整根肌纤维及坏死纤维周围正常肌纤维的肌卫星细胞都会移行到坏死部位参与修复反应［14，15］。

骨骼肌损伤后，对肌卫星细胞出现的时间有不同的结论，Hurme发现，骨骼肌损伤后第1天损伤区域没有肌卫星细胞出现，第4天再生区肌卫星细胞增生活跃，第7天肌卫星细胞数量下降。但也有研究发现，肌肉发生损伤后24 h内，在损伤部位出现组织的变性和炎症反应的同时，卫星细胞已经出现，并且由于受到损伤刺激的影响，卫星细胞已被激活，并开始表现出分裂和增殖。如Timo等［16］通过实验得出，卫星细胞在肌肉损伤后1天已开始增殖，Bischoff的卫星细胞增殖时间在损伤后18 h出现。

本研究发现，自然愈合组大鼠在损伤后第1天就有肌卫星细胞PCNA阳性核出现，伤后第2天肌卫星细胞PCNA阳性核数继续增加；在伤后第4天达高峰，损伤后第6天下降至略高于第2天的水平，这与前人的研究结果基本一致，即损伤后24 h肌卫星细胞被激活，第4天达峰值，第6天肌卫星细胞数量下降，与前人的研究结果基本上是一致的。

3.2 针刺对急性骨骼肌钝挫伤大鼠肌卫星细胞增殖的影响

本研究证明，针刺可以促进损伤肌组织肌卫星细胞的增殖及增殖高峰期提前出现。与自然愈合组相比，针刺治疗组大鼠腓肠肌中肌卫星细胞PCNA阳性核数呈急升快降趋势，伤后第2天达高峰，伤后第4天降至第2天的一半，而自然愈合组则呈缓升缓降趋势，同时，肌卫星细胞PCNA阳性核数达高峰的时间明显早于自然愈合组。针刺治疗组肌卫星细胞PCNA阳性核数在损伤后第2天就达高峰，早于自然愈合组的第4天高峰时间。在数量上，针刺治疗组在伤后第2天明显高于自然愈合组，两组比较有极显著性差异（P＜0.01），伤后第1天、第4天仅略高于自然愈合组，伤后第6天略低于自然愈合组，但两组比较均无显著性差异。表明针刺治疗组大鼠腓肠肌卫星细胞的活化、增生更为活跃，增殖高峰期出现的时间更早，提示，针刺可以有效促进损伤肌组织肌卫星细胞的增殖及增殖高峰期提前出现。依此推测针刺可能通过促进肌卫星细胞的增殖及增殖高峰期提前出现，促进肌肉的再生和修复。

3.3 针刺促进急性骨骼肌钝挫伤大鼠肌卫星细胞增殖的可能机制

近年来，临床上运用针刺治疗骨骼肌急、慢性损伤的疗效研究颇多，均证实疗效很好，但对其作用机制的研究尚不全面。一些人体和动物实验证明，针刺能促进损伤骨骼肌的结构和功能的恢复。李澎涛等［2］通过实验证实，针刺能显著改善家兔超负荷运动后损伤骨骼肌超微结构的变化，同时还能迅速降低因运动后增高的骨骼肌细胞内钙离子的浓度。1995年屈竹青等［5］再次证实，针刺能迅速降低肌肉损伤后肌细胞胞浆内增加的钙浓度，加快结构恢复。卢鼎厚［3］通过人体研究指出，阿是穴斜刺能有效治疗运动员和非运动员的急、慢性肌肉损伤，其作用机制是针刺通过加强收缩蛋白的组装、合成而促进肌肉的结构和功能恢复。同时，他也指出，阿是穴斜刺促进肌肉结构和功能恢复的作用是通过肌肉本身所固有的外周调节机制实现的，而并不是通过经络和神经体液的整体调节或中枢调节来实现。王瑞元［10］研究发现，斜刺可以阻遏大鼠大负荷运动引起的F－肌动蛋白（F－actin）延迟性解聚加强，并促进大鼠大负荷运动后作为骨骼肌再生指标的肌球蛋白重链MHC基因表达的恢复和骨骼肌超微结构变化的恢复。

骨骼肌损伤后再生的过程主要是由肌卫星细胞来完成的，而大量研究证实，肌卫星细胞的增殖、分化受多种因素的影响，如胰岛素样生长因子－1（IGF－1）、成纤维生长因子（FGF）、生肌调节因子（MRFs）等细胞因子以及低功率激光、脉冲超声波、不同频率张应变刺激等物理因素［1，8，11］。Jennische等［17］曾在大鼠的骨骼肌损伤模型中发现，IGF－1在伤后24 h内即可出现，分布在伤侧肌组织的卫星细胞中。低功率激光照射能显著地促进急性骨骼肌钝挫伤大鼠损伤局部肌组织IGF－1 mRNA的表达［4］。IGF－1不仅可促使细胞分裂增殖，还对生肌调节因子的功能有一定的影响。IGF－1调节肌卫星细胞的机制可能是利用如钙调神经磷酸酶、3－羟基—磷酸肌醇激酶、有丝分裂原激酶等多条信号传导途径进行调节，也可能是直接刺激卫星细胞增生过程［13］。罗丽［4］用低功率激光照射急性骨骼肌钝挫伤大鼠发现，在损伤后第1天、第2天、第3天和第7天，激光治疗组肌卫星细胞核数目均显著高于自然愈合组，但变化趋势大致相同；同时还发现，低功率激光照射能显著地促进急性骨骼肌钝挫伤大鼠损伤局部肌组织IGF－1 mRNA的表达。据此作者推测，低功率激光可能通过促进IGF－1 mRNA的表达，从而促进新生肌细胞的蛋白质合成，并通过提高肌卫星细胞增殖活性，促进骨骼肌细胞再生；也可能直接通过促进肌卫星细胞增殖，加速骨骼肌的再生与修复，提高骨骼肌愈合质量。另有研究发现，脉冲超声波也可明显促进肌卫星细胞增殖，加快骨骼肌挫伤的愈合速度，提高其愈合质量［12］，但其作用机制尚不清楚。关于针刺调节骨骼肌卫星细胞的激活、增殖的相关研究报道却很少，仅见史翼鹏等［9］在大强度运动后用针刺干预损伤骨骼肌发现针刺能有效促进生肌调节因子Myf－5的升高，增强卫星细胞的激活与增殖，从而促进骨骼肌损伤修复，但作者并没有对卫星细胞增殖趋势进行连续观察。针刺是否可以通过促进生肌调节因子Myf－5的升高而使卫星细胞在短期内迅速增殖？需要进一步研究。

结合前人的研究结果和本研究中针刺诱发肌卫星细胞短时间内数量增加的事实推测：针刺有可能通过促进损伤骨骼肌内源性IGF－1 mRNA提早表达或/和生肌调节因子Myf－5的升高，从而使肌卫星细胞增殖速度更快，增殖高峰期提早出现；针刺更有可能直接刺激坏死部位的肌卫星细胞和坏死肌纤维周围正常肌纤维的肌卫星细胞迅速移行到坏死部位一起参与修复反应，但其依据均需要进一步研究证实。

4 结论

1.经针刺治疗后，大鼠骨骼肌卫星细胞增殖在第2天达到高峰，而后呈下降趋势，提示，针刺可促进肌卫星细胞增殖活跃期提前出现。

2.自然愈合组大鼠骨骼肌卫星细胞增殖在第1～4天呈递增情况，在第4天达到高峰后呈缓慢递减趋势。

3.与自然愈合组相比较，大鼠骨骼肌损伤后针刺组肌卫星细胞值在第1天、第2天和第4天均高于自然愈合组，且在第2天有极显著性差异。提示，大鼠骨骼肌损伤后，针刺能促进肌卫星细胞的增殖并促使活跃期提前出现，促进骨骼肌细胞再生，加速损伤愈合的进程。

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