基因OCT4、CD133在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

倪静怡,杨 磊,朱兴华,茅国新

(南通大学附属肿瘤医院,1.肿瘤内科;2.病理科,江苏南通,226361; 3.南通大学附属医院肿瘤科,江苏南通,226001)

统计分析表明[1],ⅠA～ⅢA期能完全切除的非小细胞肺癌(NSCLC)患者5年生存率为23%～67%,晚期NSCLC的5年生存率不超过15%。虽然近年来靶向治疗使NSCLC的有效率有所提高,但总的5年生存率改变很小。导致肺癌患者出现复发、耐药及转移等现象的根源是肿瘤组织中的小部分肿瘤干细胞(CSCs)。CSCs具备无限增殖、自我更新和多向分化潜能,是形成肿瘤和促使肿瘤不断生长的根源,具有抗损伤、耐药及转移能力,针对CSCs的治疗将是治疗恶性肿瘤新的突破点。确定特异性的CSCs标记物,对CSCs的分选及靶向肿瘤干细胞药物的开发都有重要意义,但是目前尚未发现分离鉴定CSCs的统一分子标记。既往研究[2-5]发现,在多种实体瘤CSCs中均有CD133表达,并经体内外试验证实了CD133+细胞具有肿瘤干细胞特征。还有研究[6]发现,胚胎干细胞的特异性基因 OCT4在NSCLC中表达,并与CD133+肺癌细胞有一定联系。本研究采用免疫组化的方法,检测NSCLC组织、癌旁组织及正常肺组织中OCT4及CD133的表达水平,并探讨OCT4、CD133表达与临床病理特征之间的关系,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2007年5月—2009年5月间在本院经手术切除或活检、病理证实的NSCLC患者50例,均有术后随访资料。其中男27例,女23例,年龄35～70岁,中位年龄53岁;肺鳞癌29例,腺癌18例,大细胞癌3例;高分化15例,中分化29例,低分化及未分化6例;有远处转移者15例。同时选取20例癌旁组织和20例正常肺组织作为对照。

1.2 试剂与仪器

羊抗人CD133多克隆抗体、鼠抗人OCT4单克隆抗体、ELIVISON试剂盒(PV900)、二氨基联苯胺(DAB)酶底物显色试剂盒,均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

所有标本都经过10%甲醛固定、常规石蜡包埋,并制成4μm的连续切片,行免疫组化染色,将切片脱蜡至水化,高温高压修复;将抗体稀释至1∶100,取已知阳性组织作阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作阴性对照。DAB显色,用苏木精复染、脱水、透明,最后封片。采用免疫组化法分析NSCLC组织与癌旁组织、正常肺组织中OCT4和CD133表达情况,分析OCT4和CD133表达与患者的临床特征之间的关系以及NSCLC癌组织中OCT4、CD133的相关性。

1.4 判断标准

免疫组化结果观察由2名资深病理科医师共同阅片。按着色细胞百分数计分,<20%为0分,≥20%且<50%为1分,≥50%为2分;按着色强度计分,无着色为0分,淡黄色颗粒为1分,棕黄色颗粒为2分。将色细胞百分数计分与着色强度计分相乘,总计分0分为阴性(-),1～2分为弱阳性(+),4分为强阳性(6)。

2 结 果

2.1 3组OCT4、CD133蛋白的表达

50例NSCLC癌组织、癌旁组织及正常肺组织OCT4蛋白表达率分别为42.00%(21/50)、10.00%(2/20)和15.00%(3/20),而CD133蛋白表达率分别为61.00%(32/50)、10.00%(2/20)和20.00%(4/20),癌旁组织及正常肺组织OCT4、CD133蛋白的表达率均显著低于NSCLC癌组织(P<0.05)。OCT4阳性颗粒主要定位在细胞核,CD133阳性颗粒主要定位在细胞膜,均呈散在或小簇分布,见图1。

图1 NSCLC肿瘤组织免疫组化染色示例图 (20倍) A.OCT4免疫组化染色 (1例腺癌患者); B.OCT4免疫组化染色 (1例鳞癌患者); C.CD133免疫组化染色 (1例腺癌患者); D.CD133免疫组化染色 (1例鳞癌患者)

2.2 OCT4、CD133蛋白与NSCLC患者临床病理特征的关系

OCT4在低分化及未分化癌组织中的表达率高于高、中分化组织(P<0.05),OCT4及CD133在有远处转移的NSCLC癌组织中的表达率高于无远处转移(P<0.05),提示OCT4在NSCLC癌组织中的表达率与其分化程度以及有无远处转移有关,CD133在NSCLC癌组织中的表达率与有无远处转移有关。见表1。

表1 OCT4、CD133蛋白表达与NSCLC患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 OCT4与CD133的相关性

50例NSCLC癌组织中,OCT4与CD133共同阳性15例,共同阴性12例,见表2。经统计学分析,2者之间有明显相关性(P=0.0218)。

表2 OCT4与CD133蛋白的共表达关系(例)

3 讨 论

干细胞是一种未分化的原始细胞,在特定的条件下,它可以分化成不同的功能细胞,形成多种组织和器官[7]。1997年,Bonnet等从髓系白血病患者骨髓中分离鉴定出第1个CSCs:白血病干细胞,其表型为 CD34+CD38-。Collins等[3]从前列腺癌组织中分离出了前列腺癌干细胞,其表型为 CD44+/α2β1hi/CD133+,这些前列腺癌干细胞在前列腺癌组织所占的比例约为0.1%。接着O′Brien等[4]在结肠癌的组织中分离出了人结肠癌干细胞,它也表达CD133+,同时还发现这群细胞具有自我更新和分化重建的能力。

在白血病、前列腺癌和结肠癌等肿瘤中相继发现了CSCs之后,人们将目光聚集到肺癌上,尤其是NSCLC。2005年,Kim等[8]采用流式细胞术分选从支气管和肺泡导管交界处分离出一群细胞,其表面标志为Sca-1+CD45-Pecam-CD34+,即支气管肺泡干细胞(BASCs)。在正常情况下BASCs处于休眠状态,当支气管和肺泡发生损伤时,BASCs开始增殖,此时BASCs显现出自我更新特性,并且能够分化成其它类型的上皮细胞。另外,BASCs具有自我更新、克隆性增殖及多向分化潜能,可见BASCs具备干细胞特性。Eramo等[9]在体外实验中发现,在NSCLC组织中存在着一群表达CD133+的未分化细胞,它能在无血清培养基中不断增殖;同时Eramo还在重度免疫缺陷小鼠体内接种了1×104个CD133+的肺癌细胞,结果发现小鼠体内出现了与原发瘤相同表型的肿瘤,可见,此类细胞有着干细胞特性。Pircher等[10]经过实验发现,NSCLC中的内皮祖细胞也表达CD133,因此他们认为NSCLC中的内皮祖细胞可能来源于肺癌干细胞。

人的OCT4基因位于6号染色体上(6p21.31),长度为16.40 kb,具有多个转录起始位点,转录不同的mRNA亚型,从而翻译成多种蛋白质。Sotomayor等[11]发现在前列腺癌中有一种被认为是干细胞来源的细胞,即神经内分泌细胞,OCT4可标记此种细胞。CD133基因位于4号染色体, CD133蛋白为细胞膜蛋白超家族成员。Huang等[12]经过临床研究发现CD133+肿瘤细胞虽数量极少,但对肿瘤的增殖、分化、浸润以及复发有着重要的意义。

本研究中,在正常肺组织及癌旁组织中OCT4和CD133均呈低表达,而在NSCLC组织中阳性率分别为42.00%和61.00%;OCT4高表达与肺癌的分化程度、有无远处转移相关,与性别、年龄、病理类型等无关;OCT4表达随分化程度的降低而增高,有远处转移的组织显著高于无远处转移;CD133高表达与人类肺癌的有无远处转移相关;OCT4与CD133之间存在明显相关性。总之,OCT4和CD133在肺癌中高表达,与肺癌的分化、进展、转移有密切的关系,可作为一种有价值的分子标志物,为肺癌的早期预防和早期诊断服务。此外,OCT4分子与CD133分子在NSCLC的发生、发展、分化及远处转移上或许存在某些相关性或协同作用,有待进一步研究。

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