HPLC法测定消肿止痛巴布膏中栀子苷的含量

韦金燕 陆瑞勇

广西壮族自治区花红药业股份有限公司，广西 柳州 541004

消肿止痛巴布膏是在消肿止痛酊的基础上，采用巴布膏制剂成型技术制备改变剂型而成。处方采用木香、防风、黄藤、荆芥、细辛、五加皮等二十一味饮片组成，具有祛寒化湿，驱风通络，活血化瘀，消肿止痛的功效，用于风寒湿痹、关节疼痛、跌打损伤、瘀血肿痛等症。栀子为方中君药之一，其所含栀子苷为其主要活性成分，有关栀子苷的含量测定，已有很多报道，多为HPLC法测定，而且中国药典2010年版收载的栀子含量测定即为高效液相法［1］。消肿止痛酊未制订君药栀子的含量测定项，本文采用高效液相色谱法测定消肿止痛巴布膏中栀子苷含量，方法专属性强，稳定性、重复性好、简单、准确，结果可靠，可用于消肿止痛巴布膏的质量控制。

1 仪器与试药

日本岛津SPD－10AT高效液相色谱仪;SPD－10Avp检测器;

栀子苷 (中国药品生物制品检定所;批号:110749－200410，供含量测定用);消肿止痛巴布膏 (广西壮族自治区花红药业股份有限公司提供)，甲醇为色谱纯，水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18柱 (250mm×4.6mm，5μm);流动相为:甲醇－水 (27∶73);检测波长240nm;流速1.0m l ·min－1;柱温:30℃，理论板数以栀子苷峰计算应不低于3000。

2.2 供试品溶液的制备

取重量差异项下的供试品，剪碎，取约1.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取栀子苷对照品适量，用50%甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

取缺栀子阴性样品，照“2.2”项下供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察

精密称取栀子苷对照品适量，用50%甲醇制成每1ml含0.3276mg的对照品贮备液，分别精密量取对照品贮备液0.20，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00ml，置10ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，分别进样10μl，注入液相色谱仪，分别测定峰面积，以栀子苷对照品的进样量为横纵标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果栀子苷的回归方程为Y=1621.9X－12.89，r=0.9999(n=6)。结果表明栀子苷在0.06552～1.3104μg范围内，线性关系良好。

2.6 专属性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。结果阴性对照溶液在与栀子苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，故认为无干扰，见图1。

2.7 精密度试验

精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，连续进样测定6次，记录峰面积。结果栀子苷峰面积的RSD=0.77%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液和对照品溶液10μl，在24小时内分别进样6次 (0、1、2、4、8、12h)，记录峰面积，结果供试品溶液栀子苷峰面积的RSD=1.49%(n=6)，对照品溶液栀子苷峰面积的RSD=0.57%(n=6)，表明供试品溶液及对照品溶液在12h内基本稳定。

2.9 重复性试验

取批号20050901样品6份，除去盖衬，按上述方法提取和测定，结果栀子苷平均含量为0.890mg/g，RSD= 1.61%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知含量样品 (批号 20050901，栀子苷含量0.890mg/g)，取本品，除去盖衬，剪碎，取约0.9g，精密称定，置具塞锥形瓶中，准确加入栀子苷对照品贮备液(0.3536mg/ml)2.0m l，精密加入70%甲醇50m l，按上述制备方法及色谱条件测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算回收率，结果分别见表1。

表1 栀子苷加样回收率试验结果

2.11 样品测定

制备5批样品的供试品溶液，精密吸取对照品与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，外标法计算样品中栀子苷的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=5)

5批生产样品所用三批栀子药材中栀子苷含量平均值为5.3%，5批样品的栀子苷提取转移率约为73%，根据上述测定结果，以及根据中国药典2010年版一部对栀子药材栀子苷含量限度规定，将5批消肿止痛巴布膏中栀子苷平均含量下调20%，栀子苷提取率以58%计算，故暂定本品每片含栀子以栀子苷计，不得少于1.7mg。

3 讨论

3.1 提取条件的选择

本实验供试品溶液制备对提取溶剂 (50%乙醇、70%甲醇;70%乙醇)、提取时间 (加热回流20、30、40分钟)进行对比考察，测定的结果表明，几种溶剂的测定结果有差异性，用70%乙醇作提取溶剂含量稍高，但用乙醇 (70%和50%乙醇)作溶剂时，栀子苷色谱峰形不对称且峰形底较宽，影响积分的准确性，而用70%甲醇作溶剂时峰形较好，含量与用乙醇作溶剂的结果无显著性差异。

另外，对加热回流提取的时间进行考察，测定结果显示20、30、40分钟的回流时间对测定结果无显著性影响，但为了提取更完全，回流时间选择30分钟为宜。

3.2 最大吸收波长的选择

栀子苷对照品溶液及加流动相制成的对照品溶液(32μg/ml)，在200～400nm间进行紫外吸收光谱扫描，结果在240nm处有最大吸收，因此选择240nm作为检测波长。

本文采用HPLC法测定消肿止痛巴布膏中栀子苷的含量，方法快速，准确，结果可靠。

［1］中国药典［S］.2010.