慢性乙型肝炎患者淋巴细胞亚群变化及意义

艾 民 赵 娜 常亚娟

黑龙江中医药大学附属第一医院检验科，黑龙江 哈尔滨 150040

乙型肝炎病毒 (HBV)感染人数众多，我国HBV感染率为60%，乙肝表面抗原阳性率约10%［1］，是导致慢性肝病最常见的原因。HBV感染可以引起肝细胞的免疫性损害，其病理过程涉及到T细胞、B细胞、NK、NKT等细胞［2］。本文通过分析慢性乙肝病人与健康人免疫细胞的差异，来探讨乙型肝炎发病机制与宿主细胞免疫功能的关系。

1 材料和方法

2009年10月至2010年3月在黑龙江中医药大学附属第一医院就诊的慢性乙型肝炎病人32例和健康人20例，诊断符合肝病学会联合修订的病毒性肝炎的诊断标准［3］。乙肝患者中男23例、女9例，年龄18－63岁，平均年龄34 ±13岁，血清中谷丙转氨酶均超过正常2倍以上。所有病人均未接受过任何与肝病相关的治疗。健康对照组20例，男14例、女6例，年龄18－61岁，平均年龄34±9岁。

1.1 仪器与试剂 使用美国BD公司FACSCuliber流式细胞仪测定样本中的淋巴细胞亚群，试剂均由该公司提供。

1.2 检测方法 标本制备:(1)用K2－EDTA抗凝管收集外周静脉血2m l混匀，2m l用于流式细胞仪测定，室温下送检。(2)抗体标记:取2支检测管，分别加入如下抗体组合，每种抗体20μl。①CD4、CD8、CD3细胞亚群抗体;②CD16+56、CD19抗体;(3)上述管中加入50μl全血，混匀避光室温孵育20分钟;(4)加入500μlOPTILYSE－C溶血素，混匀避光26℃水浴溶血10分钟;(5)加入2 m lPBS洗液，振荡混匀，1500 r/min，离心5 min，弃上清;(6)重复步骤(5);(7)每管加入0.5 mlPBS洗液，混匀避光放置，2 h内完成上机检测。仪器检查达标准后开始检测。每管读取细胞5000个，将流式细胞仪检测的各亚群占淋巴细胞总数的百分比与血常规结果中淋巴细胞计数值相乘，得到各亚群细胞的数。

1.3 统计学处理 实验数据用 ±S表示。采用SPSS统计软件进行分析。多组比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验。P＜0.05有统计学意义。

2 结果

每组之间淋巴细胞亚群、淋巴细胞及白细胞总数进行比较:病人组淋巴细胞和白细胞计数显著低于对照组。淋巴细胞亚群中B细胞计数、NK细胞计数低于对照组(见表1);外周血CD4+T、CD8+细胞低于对照组 (见表2)。

表1 两组之间外周血淋巴细胞各亚群的比较 (平均值±S)

表2 各组之间外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞的比较 (平均值±S)

3 讨论

HBV主要是通过引起宿主自身的免疫反应而造成肝细胞的损伤。国内外初步研究显示，慢性乙型肝炎病人体内存在着细胞免疫功能的紊乱，T淋巴细胞亚群失衡，使机体不能有效清除入侵的乙肝病毒，导致疾病的慢性化［4－5］。我们通过检测慢性乙肝病人和正常人的淋巴细胞亚群的变化，来了解是否存在淋巴细胞亚群免疫功能紊乱。实验结果显示，与正常对照相比，慢性乙肝患者CD4+、CD8+T细胞计数减少。CD4+T为辅助性T细胞，能促进B细胞等其他免疫细胞的增殖和分化，调节体液免疫和细胞免疫; CD8+T细胞由细胞毒性T淋巴细胞和抑制性T细胞组成。国内外研究显示在急性乙肝患者体内存在着针对乙型肝炎病毒强烈多克隆CD4+T细胞反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，而在慢性乙肝患者中这种反应很弱或检测不到。这就提示乙型肝炎病毒感染后HBV特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞反应对病毒的清除和疾病的转归起重要的作用。CD4+T细胞和CD8+T细胞计数的减少，可能导致机体细胞免疫功能降低，乙肝病毒感染后不易被清除，与疾病慢性转归密切相关，但是，CD8+T细胞数量改变不能完全反映其功能上的变化，并且外周血中CD8+T细胞数量并不能完全反映肝细胞的情况。因此，尚需完善T细胞功能方面的检测及进行肝组织活检来进一步分析CTL与乙肝临床转归的关系。

慢性乙肝患者NK细胞计数低于正常对照。NK细胞是机体自然免疫的主要承担者，也是获得性细胞免疫的核心细胞。研究发现NK细胞缺陷的病人易发生多种危及生命的病毒感染，这可能与NK细胞缺乏导致的CTL功能丧失有关［6］。在对乙肝病毒的细胞免疫中HBV特异性的CTL反应对疾病的转归起着决定性作用。因此NK细胞减少可能与HBV感染后慢性转归密切相关。与正常对照相比，慢性乙肝患者外周血B淋巴细胞亚群比例升高。B淋巴细胞具有产生抗体、清除、提呈抗原、分泌细胞因子参与自身免疫等作用［7－8］，B细胞通过分泌抗体中和游离的病毒颗粒，阻止病毒进入肝细胞和阻止细胞间的病毒传播［9］。活化B细胞是一类抗原呈递细胞，能够产生大量参与免疫调节、炎症反应及造血过程的细胞因子，与慢性乙肝的关系还须进行深入研究。

综上所述:慢性乙型肝炎患者和正常人T细胞亚群、NK细胞、B淋巴细胞存在差异，慢性乙肝患者体内存在T淋巴细胞亚群失衡、细胞免疫功能紊乱及体液免疫异常的情况，这可能与乙肝病毒感染后慢性化密切相关。

［1］田瑛，邱志峰，李太生.慢性乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒携带者外周血T细胞亚群的变化和意义中华医学杂志，2005，47(185).

［2］杨斌，迟淑萍，陈黎明等.慢性乙型肝炎患儿外周血B淋巴细胞亚群的临床意义分析［J］.人民军医，2009，5:313－314.

［3］中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志，2000，8:324－329.

［4］FeiGZ，Sylvan SP，YaoGB，et al Quantitativemonitoring ofserumhepatitisB virusDNA and blood lymphocyte subsetsduring combinedprednisolone and interferon－alpha therapy in patients with chronichepatitisB.JViralHepat，1999，6:219－227.

［5］徐志强，张鸿飞，杨晓晋等.小儿慢性乙型肝炎外周血T细胞亚群和临床病理关系的研究.中华实验和临床病毒学杂志，2004，18:142－144.

［6］田志刚.NK细胞研究的几个热点问题.中国免疫学杂志，1999，15: 142－144.

［7］Baumgarth N，Herman OC，Jager GC，et al.B－1 and B－2 cell－derived immunoglobulin M antibody are nonredundant components ofthe protective response to influenza virus infection［J］.JExp Med2000，192(2):271.

［8］Martin F，Oliver AM，Kearney JF·Marginal zone and B1 B cellsunitein the early response against T－independent blood－borne particu－late antigens［J］.Immunity，2001，14(5):617.

［9］Toubi E，Kessel A，Peri R，Shmuel Z，et al.Enhanced apoptosis ofperipheral CD5－negative B lymphocytes from chronically hepatitis Cvirus－infected patients:Reversal after antiviral treatment［J］·JVirol，2004，78(20):11 379.