高效液相色谱法同时检测生物样品中利多卡因和MEGX

李江涛，严 鹏，尉志文，贠克明

利多卡因（Lidocaine）是椎管内麻醉常用的酰胺类药物，由于椎管内结构特殊等原因［1，2］，由利多卡因所引起麻醉意外等人身伤亡案例［3－5］时有发生。利多卡因入体后大部分经肝药酶（细胞色素P450）代谢为单乙基甘氨酰二甲苯胺（MEGX），MEGX影响着利多卡因的疗效及毒性［6，7］，同时检测利多卡因和MEGX含量对多卡因麻醉意外的法医学鉴定意义重大。本实验建立生物检材中利多卡因和MEGXA的高效液相色谱法（HPLC）检测方法，并应用于利多卡因麻醉意外法医毒物动力学研究。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 盐酸利多卡因注射液（2%，国药准字H31021071）购于上海复星朝晖药业有限公司，利多卡因标准品购自公安部物证鉴定中心（Lot：SW1083），MEGX标准品购自公安部物证鉴定中心（Lot：6938292），普鲁卡因标准品购自公安部物证鉴定中心，甲醇为TEDIA公司生产。除甲醇为色谱纯，其他均为分析纯。

日本岛津LC－20AT高效液相色谱仪，Dikma迪马科技C18二代色谱柱，SPD－20A紫外检测器，N3000色谱工作站。

1.2 仪器分析条件 Dikma C18柱（迪马科技5μm；250 mm×4.6 mm）；柱温25℃；流动相：甲醇：磷酸缓冲液（15 mmol/L，p H＝3）＝30：70；检测波长229 nm；流速1 m L/min；进样量20μL；工作站：N3000色谱工作站。

1.3 给药方案和样品采集 健康本地犬9只，蛛网膜下腔注射组（6只）和对照组（3只）。蛛网膜下腔注射组：蛛网膜下腔穿刺后，于5 min内向蛛网膜下腔注入LD50（15 mg/kg）剂量利多卡因；对照组：以等体积生理盐水代替利多卡因，其余处理同蛛网膜下腔注射组。所有实验犬于死后即刻提取心血、肝脏待检。1.4 心血和肝脏样品处理与分析 待测固性样品1 g或血液1 m L，加蒸馏水2 m L，固性样品超声匀浆3 min，加内标普鲁卡因50μg，振荡5 min；10%HCl调酸p H＝2～3，振荡5 min，3000 r/min离心10 min，提取上清液；上清液用10%NaOH调碱p H＝11～12，震荡2 min，加乙醚5 m L，振荡15 min，3000 r/min离心10 min，取上层乙醚液；乙醚5 m L重复提取一次；合并乙醚液，40℃水浴挥干。残渣用500μL甲醇定容，通过针筒式滤膜过滤器（孔径0.45μm）过膜后，按上述仪器条件进样20μL，液相色谱工作内标工作曲线法定量分析样品中利多卡因及MEGX。

2 结 果

2.1 利多卡因、MEGX及内标普鲁卡因液相色谱图（见图1～图3）

图1 利多卡因、MEGX、普鲁卡因标准高效液相色谱图

图2 染毒血中高效液相色谱图

图3 染毒肝中高效液相色谱图

2.2 工作曲线 分别取空白心血1 m L和空白肝脏1 g各14份，置于离心管中，每管分别添加利多卡因及 MEGX各0.01 μg、0.03μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.6μg、1.0μg、2.5μg、5 μg、10μg、30μg、50μg、100μg、150μg，配制成为标准系列，并依次加入内标液普鲁卡因50μg，按1.4前述方法提取与检测。以利多卡因或MEGX浓度（X）对利多卡因或MEGX与内标物峰面积比值（Y）作线性回归，心血和肝脏中利多卡因液相色谱检 测的回归方程分别为Y＝0.217X＋0.019和Y＝0.214X＋0.113，相关系数分别为0.996和0.988，线性检测范围均为（0.2～100）μg/m L、最低检出浓度分别为0.05μg/m L或μg/g；心血和肝脏中MEGX液相色谱检测的回归方程分别为Y＝0.514X＋0.033和Y＝0.440X＋0.292，相关系数分别为0.995和0.993，线性检测范围均为（0.2～20）μg/m L、最低检出浓度分别为0.05μg/m L。

2.3 精密度和提取回收率 分别取含2μg、10μg、50μg的利多卡因标准甲醇溶液和含 MEGX 2μg、10μg、50μg的 MEGX标准甲醇溶液各20μL进样，每个样品每日测定5次，连续测定3 d，其日内、日间相对标准差为1.5%～2.7%和2.0%～3.7%。

取空白检材1 m L（1 g）/份，共9份，分别加入利多卡因和MEGX标准品10μg与2μg（3份）、30μg与5μg（3份）、50μg与10μg（3份），按1.4前述样品处理方法处理并检测，计算回收率。心血中利多卡因和MEGX的回收率为（99.3±5.0）%～（101.2±4.0）%，肝脏中利多卡因和 MEGX的回收率为（98.1±4.8）%～（104.2±4.4）%。

2.4 染毒死亡犬体内利多卡因及MEGX含量 染毒死亡犬心血和肝脏经提取后，以内标工作曲线法计算样品中

利多卡因及MEGX含量。心血利多卡因及MEGX含量分别为（14.50±1.64）μg/m L和（1.64±0.22）μg/m L，肝脏利多卡因及 MEGX含量分别为（14.90±1.19）μg/mg和（2.53±0.36）μg/mg。

3 讨 论

据相关文献报道，同时检测利多卡因和MEGX常使用GC［8］和 HPLC［9］法。由于 MEGX的化学性质，GC和 GC/MS在检测MEGX时，必须先进行衍生化处理，才能进一步检测；而所报道HPLC法多采用乙腈等高成本流动相，并且检材前处理发放繁琐［10］。本实验建立同时检测生物检材中利多卡因和MEGX的HPLC方法，该方法在选定条件下利多卡因、MEGX、普鲁卡因（内标）能够与其他杂质峰良好分离（普鲁卡因Rt＝4.03min，MEGX Rt＝10.17 min，利多卡因Rt＝13.228 min，分离度Rs＞2），峰形对称，分离效果好，在较高浓度范围内有较好的线性关系，提取回收率及精密度均达到检案要求，且重现性好，检材前处理简单，灵敏度高，可用于生物检材中利多卡因和MEGX的分析测定。

有关报道中提取利多卡因是在p H为9的碱性环境［11］，但本实验发现利多卡因和MEGX在提取环节中对p H非常敏感，利多卡因在p H为9时回收率较高，而MEGX在该p H下回收率却比较低，通过动物实验并考虑到实际案例，经反复实验，最终选用p H在11～12范围，可保证利多卡因和MEGX都具有较高回收率。

本实验结果显示，各脏器中利多卡因含量较MEGX含量高，与文献报道［12］利多卡因在蛛网膜下腔麻醉致死犬体内的含量分布一致。

本实验所建立方法能够快速准确定性定量分析样品中的利多卡因和MEGX，同时能够应用于临床麻醉意外病人药物浓度检测，麻醉意外的法医学鉴定，以及进一步的毒（药）物动力学研究。

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