山茱萸总苷干预急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的研究1）

陈克芳，李建军，潘爱珍，黄启辉，侯祥平

1 材料与方法

1.1 动物 出生1 d～3 d的SD大鼠，由中山大学实验动物中心提供。

1.2 试剂 DMEM/F12培养基，吉诺生物医药技术有限公司产品；DMEM无糖培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，Gbico公司产品；0.25%胰蛋白酶，吉诺生物医药技术有限公司产品；青霉素－链霉素溶液，Gibco公司产品；抗α－Sarcomeric actin，武汉博士德生物有限公司产品；TUNEL－QIA39细胞凋亡试剂盒，购自Merck公司；SABC试剂盒及DAB显示试剂盒，购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 药物 山茱萸，广东一方制药有限公司提供。

1.4 主要仪器 CO2细胞培养箱，Thermo公司；荧光显微镜，Nikon公司。

1.5 方法

1.5.1 山茱萸总苷提取物制备 由广东省中医研究所按文献［1］方法提取，提取物浓缩干燥至粉末状。

1.5.2 心肌细胞原代培养 将出生1 d～3 d的SD大鼠，用75%酒精消毒后取出心脏，迅速放入4℃预冷D－Hank’s液的培养皿中，洗去心脏表面及血管中的血细胞，剪去心房和大血管。将心脏剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，加入约10 m L0.125%胰酶消化液，于37℃水浴箱中分次消化，每次约10 min。收集除第1次以外的细胞悬液于50 m L离心管中，加入含量为10%FBS的DMEM/F12培养液，终止消化。1000 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培养液，轻轻吹打使其形成单细胞悬液，将细胞悬液吸入培养皿中，按差速贴壁法于37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5 h，去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。之后轻轻收集尚未贴壁的细胞悬液，调整细胞密度为1×105/m L～5×105/m L，接种于6孔培养板中。细胞于37℃、5%CO2环境中培养，每2天换一次液，培养3 d～4 d后使用［2］。

1.5.3 实验分组 缺氧模型组：正常培养3 d的心肌细胞弃去培养液，换成无糖DMEM液，用无菌液状石蜡封住液体表面，使细胞缺氧［3］。对照组：心肌细胞不做任何处理，正常条件培养。山茱萸总苷干预组：细胞缺氧处理之前24 h在培养液中加入0.49 g/L的山茱萸总苷，缺氧培养的同时亦加入0.49 g/L的山茱萸总苷进行干预。各组设1 h、2 h、3 h、5 h 4个时间点进行指标观察。

1.5.4 心肌细胞的鉴定 按照SABC抗α－横纹肌肌动蛋白试剂盒说明方法：将培养3 d的细胞爬片，用4%多聚甲醛固定30 min。然后用30%H2O21份＋纯甲醇50份混合液室温浸泡30 min后蒸馏水洗1次～2次，滴加5%BSA封闭液，室温20 min，甩去多余液体，滴加1∶100稀释的一抗（小鼠抗大鼠α－Sarcomeric actin），对照组用蒸馏水代替一抗，37℃孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20 min，PBS洗2 min×3次。滴加试剂SABC，37℃20 min，PBS洗5 min×4次。二甲苯透明，中性树胶封片［4］。

1.5.5 TUNEL检测心肌细胞的凋亡率 将培养的细胞爬片，4%多聚甲醛固定，室温孵育10 min后，将玻片浸没在1×TBS溶液中，室温孵育15 min。每个样本玻片上滴加50μL～100 μL浓度为20μg/mL的蛋白酶K溶液，室温孵育5 min。用1×TBS溶清洗样本2次～3次。滴加100μL×Td T平衡缓冲液，室温孵育20 min后，在每个样本上立即滴加60μL Td T标记反应混合物，置于湿盒中于37℃孵育90 min。将样本玻片置于1×TBS溶液中室温孵育1 min。去掉多余液体，换用新鲜1×TBS溶液室温孵育1 min，重复1次。用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的TBS溶液，逐滴滴加Mounting Media封片剂并盖上 盖玻片。使用荧光显微镜分别用330 nm～380 nm及465 nm～495 nm波长下激发荧光，计数所有细胞和凋亡细胞，计算出凋亡率［5］。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0进行数据分析，图片制作采用SPSS13.0及EXCEL进行，计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组计量数据的比较采用t检验，多组数据之间的比较采用单因素方差分析（One－way ANOVA），检验水平取α＝0.05。

2 结 果

2.1 心肌细胞培养 在倒置相差显微镜下观察，培养24 h后，细胞已基本贴壁，并伸出伪足，形态呈梭形、菱形或不规则多边形。培养72 h后，心肌细胞融合成片，形成单细胞层，细胞搏动呈现同步化，每分钟120次左右。

2.2 心肌细胞鉴定 心肌细胞中含有α－Sarcomeric actin，本实验选用的一抗为小鼠抗大鼠α－横纹肌肌动蛋白，因此染色后心肌细胞胞浆将被着深棕色，而非心肌细胞则呈阴性染色。心肌细胞的纯度鉴定采用每张玻片随机取10个视野，分别计算出心肌细胞阳性率，重复3次并取平均值为97.26%、96.875%、96.97%，三者取平均值为97.035%，因此本实验心肌细胞的纯度为97.035%。

2.3 TUNEL检测心肌细胞的凋亡率（见表1） 正常对照组心肌细胞凋亡率极低。而在心肌细胞缺氧2 h后凋亡率明显增高 ，3 h～5 h后达到高峰，与对照组相比，差别有统计学意义（P＜0.01）。用山茱萸总苷干预治疗后，治疗组与缺氧组相比凋亡率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组心肌细胞的凋亡率比较（ ±s） %

表1 各组心肌细胞的凋亡率比较（ ±s） %

组别 凋亡率对照组 0.55±0.05缺氧组 1 h 16.22±1.001）2 h 60.81±3.311）3 h 96.12±1.331）5 h 98.77±0.431）治疗组 1 h 4.06±0.252）2 h 10.14±0.622）3 h 15.27±1.182）5 h 27.53±1.282）与对照组比较，1）P＜0.01；与缺氧组相比，2）P＜0.01

2.4 山茱萸总苷干预急性缺血乳鼠心肌细胞TUNEL染色结果 对照组正常心肌细胞阳性着色的细胞核很少；随着缺氧时间延长，阳性着色比例较对照组组明显增多；治疗组较缺氧组阳性着色比例明显减少。

3 讨 论

长期以来，细胞坏死一直被认为是缺血性心肌死亡的唯一方式［6］。但是最近研究结果显示，急性心肌梗死时早期心肌细胞死亡的主要方式为细胞凋亡，而不是心肌细胞的坏死，并且心肌梗死晚期也存在心肌细胞的凋亡［7，8］。心肌细胞凋亡与坏死是完全不同的，有研究［9］证实细胞凋亡于心肌缺血2 h后发生，4 h～5 h时最明显，6 h后开始减少，这点在本研究中也得到了验证。结果显示，原代培养的SD乳鼠心肌细胞在正常情况下几乎没有心肌细胞的凋亡，但在缺氧时可以引起心肌细胞的凋亡，并且随着缺氧时间的延长，凋亡细胞不断增加，缺氧5 h时达到最高，凋亡率几乎达到98%。因此，防治心肌细胞凋亡是治疗急性心肌梗死新的治疗靶点。

现代药理研究表明，山茱萸总苷有抗炎和杀菌作用［10］，抗氧化损伤作用［11］，对急性缺血缺氧的心肌具有保护作用［12］。急性心肌缺血时线粒体的能量耗竭及活性氧的释放是导致心肌细胞凋亡和坏死的主要病理改变，已有研究证实，中药山茱萸对于实验性心肌梗死大鼠模型的心肌细胞具有保护作用。本实验研究发现，给予山茱萸总苷干预后，缺氧乳鼠心肌细胞凋亡率明显下降，而且各个时间点的凋亡率均降低。可见山茱萸总苷可以抑制心肌细胞的凋亡，保护缺氧心肌细胞。但山茱萸总苷通过什么作用途径抑制心肌细胞凋亡，尚需深入研究。

［1］吴红，梁恒，刘永红，等.山茱萸总皂苷的提取分离与含量测定［J］.第四军医大学学报，2003，24（5）：430.

［2］辛毅，许秀芳，黄益民.乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定［J］.新乡医学院学报，2011，28（5）：541－547.

［3］曾文静，刘菊英，柯昌斌.液体石蜡封闭法建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型［J］.郧阳医学院学报，2010，29（2）：108－110.

［4］张乃菊，陈天平，祝晓光.乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养［J］.蚌埠医学院学报，2010，35（6）：558－561.

［5］王嘉宁，郭宁.细胞凋亡的检测技术与方法［J］.中国药理学与毒理学杂志，2005，19（6）：466－470.

［6］Gill C，Mestril R，Samali A.Losing heart：The role of apoptosis in heart disease a novel therapeutic target［J］.FASEB J，2002，16：135－146.

［7］Yin RX，Yang DZ，Li JQ.Effects of cardiotrophin－1 on hemodynamics and cardiomyocyte apoptosis in rats with acute myocardial infarction［J］.J Med Invest，2004，51（1－2）：29－37.

［8］聂园园，仇小强.心肌细胞凋亡与心血管疾病关系的研究进展［J］.实用医学杂志，2012，28（2）：324－326.

［9］马桂兰.细胞凋亡与冠心病［J］.医学综述，2000，11（6）：491－492.

［10］付桂香，李建民，周勇，等.山茱萸总苷抗炎免疫抑制作用及其机理的大鼠实验研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2007，27（4）：316－320.

［11］李光燮，朴成哲.山茱萸总苷对四氯化碳诱导的急性肝损伤的影响［J］.山东医药，2011，51（20）：43－45.

［12］唐志书，郭立玮，王斌.三七总皂苷/山茱萸总皂苷组分对犬冠状动脉结扎缺血心肌的保护作用研究［J］.时珍国医国药，2011，22（1）：72－74.