锦鲤疱疹病毒病的诊断病例

李新伟，周井祥，朱 霞，王 好

（吉林农业大学动物科技学院 动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林 长春 130118）

锦鲤疱疹病毒病（koi herpesvirus disease，KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（koi herpesvirus，KHV）感染锦鲤、鲤及其普通变种如框镜鲤等而导致的一种具有高度传染性和致死性的疾病。该病多发生在水温为18℃～28℃的春秋季节，具有高度传染性，发病率和死亡率均可高达80%～100%［1］。

该病于1998年首次在以色列的 Magan Michael地区和美国暴发［2］，之后迅速传播至世界各地。目前，该病在我国的鲤鱼养殖中频繁暴发，给鲤鱼养殖业带来了严重危害。2007年国家质检总局发布警示预报，要求将KHV作为必检项目，并将KHV和鲤春病毒病（spring viraemia of carp，SVC）一起作为近年来水生动物疫病的重点监测对象，但是目前国内还没有制订有关检测标准。本试验综合临床症状观察、剖检、细胞培养分离技术及聚合酶链式反应（PCR）技术，对吉林省伊通县某鲤鱼养殖场一例疑似KHVD病例进行了确诊，报告如下。

1 临床诊断

2011年8月份因试验需要，本实验室从吉林省伊通县某鲤鱼养殖场购买了600尾一日龄鲤鱼。自购买的当天晚上开始，所购买鲤鱼出现游泳异常，反应迟钝，呼吸困难，体表附有白色的不规则白斑，进而整个体表披上白色云雾状膜等症状。第2天该批鲤鱼出现死亡，死亡鱼鳃出血坏死，眼睛凹陷，剖检后发现内脏器官－肾脏充血肿大呈暗红色；肝、胰脏肿大呈灰白色。由于临床症状与剖检结果均与英国、以色列、美国等国家报道过的锦鲤疱疹病毒病极相似，因此初步确定此批鱼感染了KHV。

2 实验室诊断

2.1 细胞分离技术检测 取活体患病鱼，无菌取出肾脏，制备成肾细胞悬液，将其接种于框镜鲤尾鳍原代细胞（MFC）单层，22℃下吸附1 h后，加入含有5%血清的M199，22℃条件下继续共培养。逐日观察细胞病变情况，最后收集细胞病变达70%～80%的细胞及上清液，进行电镜观察。

2.2 PCR检测 参考GenBank公布的KHV美国株全基因序列，选取大小为771 bp的ORF81基因，应用Primer 5.0软件设计1对特异性诊断引物，F1：5′-GGATCCATGGCAGTCACCAAAG-3′；F2：5′-GTCGACTCACCACATCTTGCCG-3′，扩 增 片段大小为771 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

按照常规方法提取发病鲤鱼肾脏组织DNA后，采用25μL反应体系进行PCR扩增。具体反应体系为：在0.5 m L PCR管中依次加入1μL DNA产物，2μL d NTP，0.25μL ExTaqDNA 聚合酶，2.5μL10×PCR反应Buffer，混匀后加双蒸水补足25μL。反应条件如下：预变性95℃，5 min；变性94℃，40 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，1 min；扩增循环数为35次。最后，反应体系于72℃总延伸10 min，反应结束后4℃保存。将PCR产物与DNA Marker进行1%琼脂糖凝胶电泳，采集图像。

2.3 ORF81基因序列测序 将目的片段纯化回收后，与p MD18-T载体连接，转化至DH5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选单菌落，提取阳性重组质粒后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测序结果与NCBI上已公布的KHV ORF81核酸序列进行BLAST序列比对。

3 检测结果

3.1 细胞病变及病毒电镜观察结果 MFC接种患病鱼组织10 d后出现明显病变，病变与Pikarsky E等［3］描述的一致。电镜下观察到了典型的KHV病毒粒子，与文献描述相符［4］。

图1 MFC接种患病鲤鱼组织后产生的细胞病变

图2 电镜下观察到的病毒形态

3.2 PCR结果 如图3所示，以提取的发病鲤鱼肾脏组织DNA为模板，在预期位置扩增出KHV的特异性条带，大小为771 bp左右。

图3 基因片段的PCR扩增

3.3 测序结果 测序结果表明，患病鱼肾脏组织中扩增的目的片段与GenBank上登录的KHV美国株ORF81基因序列的同源性为99%。

4 结语与建议

根据剖检、细胞分离技术检测、PCR检测及测序结果，结合临床症状观察，确诊该鲤鱼养殖场鲤鱼感染了KHV。

由于目前KHV的传播途径及传播媒介都不是很清楚，所以还无法确定该养殖场受感染鲤鱼的病原来源。为了控制疫情流行，建议采取以下措施：首先及时向渔业主管部门上报；其次必须采取严格的隔离措施，对已发病的池塘或地区首先进行封锁，对池内的养殖动物不向其他池塘和地区转移，不排放池水，工具未经消毒不在其他池使用。与此同时，饲养人员要勤于清除发病死亡尸体，及时掩埋、销毁，以免疫情传播蔓延。

［1］Gilad O，Yun S，Andree B.Initial characteristics of koi herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in koi，Cyprinus carpio koi［J］.Dis Aqua Org，2002，48（2）：101-108.

［2］Hedrick R P，Gilad O，Yun S，etal.A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi，a strain of common carp［J］.Journal of Aquatic Animal Health，2000，12（1）：44-57.

［3］Pikarsky E，Ronen A，Abramowitz J，etal.Pathogenesis of Acute Viral Disease Induced in Fish by Carp Interstitial Nephritis and Gill Necrosis Virus［J］.Journal of Virology，2004，78（17）：9544-9551.

［4］Marina H，Ronen A，Perelberg A，etal.Description of an as Yet Unclassified DNA Virus from Diseased Cyprinus carpio Species［J］.Journal of Virology，2005，79（4）：1983-1991.