猪链球菌的分离鉴定及对常用抗菌药物的耐药性

刘 静，李贤贤，张 鹏，王淑杰，吴 悦，赵玉莲，李 鹤，李艳华

（1.东北农业大学 动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江省农垦北安管理局动物卫生监督所，黑龙江 北安 164095；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150030）

猪链球菌病是一种人畜共患的传染性疾病，在世界上广泛分布，是由C、D、L群链球菌引起的猪多种疾病的总称，在临床上主要表现为败血症、脑膜炎、关节炎、淋巴结脓肿等症状。其中，猪链球菌是引起猪链球菌病最主要的病原，引起猪脑膜炎以及败血症等疫病，人通过特定的传播亦可感染该菌［1－2］。近几年来，随着我国养猪业集约化程度的不断提高，猪链球菌病发生呈明显上升趋势，且常与猪繁殖障碍及呼吸道综合征、猪附红细胞体病、非典型猪瘟、猪圆环病毒病混合感染，一旦发生很难控制，给我国养猪业带来巨大的经济损失［3］。虽然理论上有很多药物能治疗猪链球菌病，但随着抗菌药物的广泛使用以及不合理用药，使得病原菌的耐药现象日趋严重［4－5］。为此，我们对黑龙江省某猪场采集的猪鼻腔棉拭子进行猪链球菌分离纯化、生化鉴定和PCR鉴定，并对分离菌进行了药敏试验，以期为猪链球菌病的防治工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及病料 标准2型猪链球菌菌株ATCC700794、ATCC19714，购自美国疾病控制中心。病料系从黑龙江省某猪场通过灭菌棉拭子采集的猪鼻腔分泌物。

1.2 培养基 脑心浸液肉汤培养基、脑心浸液琼脂，购自中国检验检疫科学研究院北京陆桥生物技术有限责任公司，生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 药物 青霉素 G（Penicillin G，PEN）、阿莫西林（Amoxicillin，AMO）为东北制药总厂生产；头孢唑啉（Cefazolin，CEZ）、头孢噻呋（Ceftiofur，CEF）、头孢西丁（Cefoxitin，FOX）为石药集团中润制药（内蒙古）有限公司生产；红霉素（Erythromycin，ERY），购自武汉远鸿科技开发有限公司；氧氟沙星（Ofloxacin，OF），购自河南康泰药业有限公司；磺胺甲口恶唑（Sulfamethoxazole，SMZ），购自上海元越化工有限公司。上述药品配制成一定浓度后于－20℃保存，1周内使用，临用前稀释成使用浓度。8类抗菌药物试验所用药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4 分离鉴定

1.4.1 细菌分离纯化 用无菌接种环蘸取病料接种于匹克氏肉汤中培养，37℃培养24 h后，将其接种于脑心浸液琼脂平板上，再次置37℃培养24 h后，挑取平板上表面光滑、灰白透明单个可疑菌落接种于脑心浸液肉汤做纯培养，37℃培养24 h后，进行革兰染色，观察其形态和染色特性。

1.4.2 生化试验 用分离菌纯培养物分别接种于乳糖、蔗糖、山梨醇、棉子糖、葡萄糖、甘露醇、菊糖、水杨苷、七叶苷、马尿酸盐、蕈糖、6.5%NaCl等微量生化反应管中，37℃培养24 h后，观察其生化反应特性。

1.4.3 PCR鉴定 参照文献［6］合成引物，gdh U：5′-GCAGCGTATTCTGTCAAAC G-3′ 和 gdh L：5′-CCATGGACAGATAAAGATGG-3′，扩 增 片 段大小为688 bp，对10株分离株分别进行gdh基因检测。PCR 反应条件为：95℃ 变性5min；94℃45 s，55℃45 s，72℃30 s，30个循环；最后72℃延伸10 min，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。1.5 药敏试验

1.5.1 K-B试验 采用K-B纸片法。将分离的猪链球菌接种于脑心浸液肉汤培养基中，37℃过夜培养。比浊法将菌液浓度先调整为0.5麦氏单位（1.5×108CFU／m L），然后用脑心浸液肉汤培养基稀释至浓度约为1.5×105CFU／m L。取1.5×105CFU／m L菌液100μL接种于脑心浸液琼脂平板上，用涂布棒均匀涂开，

然后将药敏纸片贴于平板上，两片之间的距离以1～2 cm为宜，纸片距平皿边缘约1.5 cm，置于37℃培养箱培养18～24 h后，测定抑菌圈的直径，并用美国NCCLS标准（1999～2001）对结果进行判定［7］。

1.5.2 体外最小抑菌浓度（MIC）测定 严格按照NCCLS标准［7］推荐的标准微量稀释法进行，首先将分离的猪链球菌菌液浓度调整为0.5麦氏单位（1.5×108CFU／m L），然后用脑心浸液肉汤培养基稀释至浓度约为1.5×105CFU／m L后，将菌液接种于含不同药物浓度的96孔板中，37℃培养18～24 h，观察结果，计算细菌对各抗菌药物的耐药率。

2 结果

2.1 分离培养及染色镜检 从采集的病料中分离得到10株革兰阳性球菌，分别将其编号为：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。分离菌在脑心浸液琼脂平板上菌落呈半透明、表面光滑、微隆起的淡灰白色状的小菌落；镜检呈单个、成双或短链状排列的革兰阳性球菌。

2.2 生化试验 对分离到的10株革兰阳性球菌进行生化试验，生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，鉴定结果见表1。

表1 生化试验结果

2.3 PCR鉴定结果 以分离株基因组DNA为模板经PCR检测后，10株分离菌株gdh基因的检测结果均为阳性（图1），确定为猪链球菌。

2.4 药敏试验结果

图1 猪链球菌菌种PCR鉴定结果

2.4.1 K-B试验结果 分离自猪场的10株猪链球菌对各抗菌药物的耐药结果显示，所有的菌株对8种药物有不同程度的敏感性，但所有的菌株均对青霉素G、阿莫西林敏感；而对头孢西丁、红霉素、磺胺甲口恶唑3种药物100%耐药。结果见表2。

表2 10株猪链球菌分离株的药敏检测结果

2.4.2 体外最小抑菌浓度的结果 根据NCCLS的判断标准，试验统计结果显示，8种抗生素中，对猪链球菌抑菌作用最强的是青霉素G、阿莫西林，高度敏感株达100%。头孢唑啉、头孢噻吩对菌株敏感度在40%～80%之间。而头孢西丁、红霉素、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑敏感度为0%。结果见表3。

表3 8种抗菌药物对10株猪链球菌分离株的MIC测定结果

3 讨论

本试验从采集的猪鼻腔分泌物中分离到的10株细菌，根据培养特性、染色特点、形态观察、生化试验及PCR鉴定确定为猪链球菌。本试验表明该猪场已出现猪链球菌感染。猪链球菌是一种能引起人、猪和其他动物感染、发病的重要致病菌。据报道，猪链球菌血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病猪中经常流行的血清型，其中以2型流行最广、致病性最强，从发病动物中有较高的分离率。但不同血清型菌株之间毒力有较大差异，并非所有的血清型均具有致病性，其与动物致病性有很大关系［8］。本实验室对猪链球菌分离株进行的PCR分型鉴定却未能检测出上述血清型。为了有利于此病的控制，仍需作进一步细致的研究。

本次药敏试验结果表明，猪链球菌分离株对β－内酰胺类抗生素如青霉素G、阿莫西林、头孢唑啉、头孢噻呋的敏感性较高，其中青霉素G、阿莫西林抗菌活性最高，可作为该猪场防治猪链球菌病的首选药物，但是对头孢西丁产生了明显的耐药性。此外，结果还发现，大部分菌株具有多重耐药性，所有分离株对红霉素、氧氟沙星、磺胺甲口恶唑的耐药性尤为严重。其与我国其他学者在东北地区对猪链球菌耐药菌株所作的耐药性研究相符［9－10］。由此表明，本地区的猪链球菌对大环内酯类药物、喹诺酮类药物和磺胺类药物可能产生了高耐药性。

猪链球菌菌株对抗菌药物耐药性的产生，一方面由于抗菌药物长期应用导致的“选择性压力”筛选和抗菌药物的不合理使用加速细菌发生基因突变获得耐药性除外，耐药基因在菌株中的广泛传播至关重要［11－12］。国外的研究表明，细菌能通过携带可转移遗传因子包括质粒、转座子、噬菌体和整合子基因盒系统等使耐药性扩散传播，其中整合子潜在的基因捕获及整合表达能力，对细菌耐药性传播可能是一种更为严重的威胁［13－15］。而这种扩散传播可能发生在土壤内，也可能是发生在人类或动物肠道内。1959年医务人员已开始认识到在志贺氏菌中发现的耐药基因可通过质粒转移至大肠埃希氏菌中。本试验研究的猪链球菌，有人报道过其是通过转座子Tn1545在菌间传播的［16］。由此表明耐药不仅存在于致病菌中，也存在于共生菌中，而且在食物、环境和动物中存在。

猪链球菌是革兰阳性菌，从理论上讲，其抵抗力不强，在治疗上，很多药物对其都有疗效，但近年来由于抗生素的滥用，如在动物饲料中长期添加抗生素用于促进生长及预防和治疗疾病，发生疾病后未经兽医诊断就盲目使用大量多种抗菌药物等，在抗菌药物的选择压力下，猪链球菌产生了大量耐药菌株。因此，建议猪场在防治猪链球菌病时，最好先做药敏试验筛选敏感药物，选用两种或两种以上的敏感药物交替使用。其不仅可以防止抗药菌株的产生，指导临床用药，而且对于预防猪链球菌继发感染，有效降低这些疾病造成的损失同样具有重要指导意义。

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